严格质控流程：

1．RNA抽提

采用miRNeasy Mini Kit (Qiagen, 217004)进行RNA纯化，确保提取的RNA片段长度大于18个核苷酸（nt），从而获得高质量的总RNA。该试剂盒专为高效提取RNA设计，能够有效去除杂质，保证RNA的完整性和纯度。

2．样本质检
所有样本均采用Agilent 4200 TapeStation系统进行全面质检，而非仅进行抽检。通过该系统，可以精确测量每个样本的RIN值（RNA完整性指数）、28S/18S rRNA比值、总RNA量值以及浓度值。此外，每个样本还会生成单独的电泳峰值图片，直观展示RNA的完整性。这种全面且细致的质检方式，符合发表在高水平学术杂志上对RNA样本检测的最高标准，确保实验数据的可靠性和重复性。

RNAseq-polyA 提取

• 原理：真核生物的大多数mRNA在3'端都有一个polyA尾，通过使用带有oligo(dT)的磁珠可以特异性地捕获这些polyA+的RNA分子。

·  目的：富集mRNA和其他polyA+的非编码RNA，同时去除大部分非polyA的RNA（如rRNA），从而提高测序效率。

建库

• 步骤：
  • RNA片段化：将提取的RNA片段化，以便后续的cDNA合成。

·  3'端适配器连接：将3'端适配器连接到polyA+ RNA的3'端。

·  逆转录合成cDNA：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。

·  PCR扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得足够的量用于测序。

·  特点：该过程需要精确控制反应条件，以确保高质量的文库构建。

测序（MGI 6G 华大平台）

• 平台介绍：MGI 6G是华大基因开发的测序平台，具有高通量、高准确性和低成本的特点。

·  测序原理：基于联合探针锚定聚合技术（cPAS）和DNA纳米球技术，能够快速准确地读取DNA序列。

·  优势：适用于大规模转录组测序项目，能够提供丰富的转录组信息。

标准分析

• 内容：
  • 质量控制：对测序数据进行质量评估和过滤，去除低质量读段和接头序列。

·  比对分析：将高质量的测序读段比对到参考基因组上，确定转录本的位置。

·  定量分析：计算每个基因或转录本的表达量。

·  差异表达分析：比较不同样本之间的基因表达差异。

·  polyA尾分析：研究polyA尾的长度分布和变化，这对于理解基因表达调控具有重要意义。

·  意义：通过标准分析，可以全面了解样本的转录组特征，为后续的生物学研究提供重要依据。

整个“RNAseq-polyA 提取+建库+测序 MGI 6G（华大平台）+标准分析”的流程，是研究转录组中polyA+ RNA分子的有效手段，广泛应用于基因表达调控、疾病机理研究等领域。