免疫共沉淀( CoIP ) 实验技术服务

一、项目名称：免疫共沉淀检测蛋白相互作用。

免疫共沉淀(CoIP)指用抗体用于从混合样品中富集纯化其靶抗原及其结合蛋白。在这种情况下，抗原是诱饵蛋白，其结合蛋白是通过抗体--抗原相互作用共同纯化的相互作用的蛋白。

二、实验准备

2.1    样品

细胞 （甲方提供）。

2.2    实验仪器

蛋白电泳仪（Bio-Rad）蛋白转印系统（Bio-Rad）

化学发光成像系统（Tanon）

旋转仪 TR-02U(HYQ-2231)（CrystalTechnology&Industries）

恒温金属浴（Thermo）

2.3    实验试剂

Protein A/G Magnetic Beads (BioLinkedin)

IP 细胞裂解液（Beyotime P0013）

蛋白酶抑制剂混合物（Roche 4693159001）

BCA 蛋白浓度测定试剂盒（BeyotimeP0009）蛋白Marker（Tanon BiostepTM）

三、Co-IP实验目的：

（1）测定两种甚至更多种蛋白质是否在体内结合；

（2）鉴定一种特定蛋白质的作用搭档；

（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

四、技术路线

（一）、样品制备

1.    用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次，最后一次吸干磷酸缓冲液；细胞利用胰酶消化或用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离，PBS 洗两次。

2.    加入预冷的 Co-IP Buffer（1 ml/107 个细胞、10cm 培养皿或 150cm2  培养瓶，

3.    0.5ml/5×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2   培养瓶），Co-IP Buffer 中加入蛋白酶抑制剂 Cocktail;

4.    4°C，14000rpm  离心 15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

5.    做蛋白标准曲线（BCA 法），测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10  倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20°C 保存一个月）；

6.    用 Co-IP Buffer 将各组总蛋白稀释到统一浓度。留取 100μL 细胞裂解液作为

7.    Input 检测目的蛋白表达。

（二）、磁珠的准备

8.    用移液枪轻柔吹打重悬 ProteinA/G 免疫磁珠，转移 25-50μL 混合液到新的离心管中。

9.    加入 500μL Co-IP Buffer，用移液枪轻柔吹打重悬 ProteinA/G 免疫磁珠，磁力架上静置 10s 后, 去除上清，重复上述步骤 2 次。 注意：多个样品时，磁珠预处理后再分装到各个反应管中。

（三）、样品的结合

10.  在上述沉淀中分别加入 500μL 细胞裂解液，10μL 相应的抗体，室温缓慢孵育2 小时或者 4°C 条件下过夜。

11.  磁力架上静置 10s 后，将上清液转移到新的离心管中备用（上清液可用于检测蛋白是否存在残留）。

（四）、洗涤

12.  使用 0.5 mL Co-IP Buffer 洗涤第 9 步中的沉淀。

13.  重复洗涤大约 3 次，直到洗涤后的上清液中 OD280 小于 0.05 为止。蛋白洗脱

14.  根据下游用途选择洗脱方法。对于直接检测目的蛋白的情况，在上述所得沉淀中加入 50μL  1×蛋白上样缓冲液，金属浴煮沸 5min，冷却至室温并在磁力架上静置 10s。

15.  取上清进行 SDS-PAGE 检测目的蛋白

五、技术路线

Co-IP实验，首先证明靶蛋白A和预测的与其相互作用的蛋白B存在于蛋白质样品中，将抽出来的蛋白样品直接检测靶蛋白A和蛋白B的存在，即Input过程。

为了证明IP抗体是不是能拉下来靶蛋白，做完IP后需要检测靶蛋白。注意：western的一抗不一定能作为IP抗体去捕获靶蛋白，因为western检测时，蛋白是变性的状态，空间结构已经发生了变化。很多抗体在制备时使用的是合成的肽段作为抗原，这样的抗体不一定能识别非变性状态下折叠起来的目的蛋白。所以选IP抗体时一定要根据抗体的介绍上提到的应用（类似ChIP, Flow Cyt, ICC/IF, IHC-P, IP, WB等）进行判断，即使购买的抗体说是可以用于IP的，其在不同样品中的效果需要根据实际检测效果决定。

靶蛋白A不能检测到的原因：

1．IP抗体有问题，需要换不同的抗体进行试验。

2．beads没有结合上IP抗体，这个原因可以通过WB来检测是否包被好。常用的抗体大多数为鼠源或者兔源，进行WB实验时通过重链/轻链即可判定beads是否偶联上抗体。

3．可能是蛋白A表达水平过低，这种情况可以加大样品量来解决。

如果内源性 Co-IP，Input也没有检测出来，可能的原因是样品本身靶蛋白含量太低或者蛋白提取没有做好，当然，抗体原因也不容忽视。所以我们一般情况可以先尝试做过表达的Co-IP。

IP后A、B蛋白都能检测到，固然是值得高兴的，但是这结果是不是假阳性呢？还得做个阴性对照，目前文献中常提到有几种方法：

（1）只加入beads不加入IP抗体

（2）加入一种不相干的蛋白的抗体作为IP抗体

（3）加入正常IgG作为IP抗体

（4）使用不表达靶蛋白A但表达B的蛋白样品做对照。

另外，CO-IP（免疫共沉淀）一般分为内源性和外源性，即内源性CO-IP是检测细胞本身含有的蛋白A和蛋白B互作有无；外源性CO-IP是将蛋白A和蛋白B在细胞内过表达后，再检测二者互作有无。

对于内源性Co-IP实验，如果出现阴性结果，也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致，这种情况也可以先做过表达Co-IP作为对照。

只有设置了正确的对照，出来的结果才是可以被合理解释的，也是被认可的。

首先，我们了解相关名称

IB：即immunoblotting（免疫印迹）也就是常规的WesternBlotting，用于检测目的蛋白。

IP：即immunoprecipitation（免疫沉淀）这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

Input：全细胞裂解液，可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞样品，在做IP实验之前，需要预留Input，在检测IP的结果同时确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体

IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同种属来源，如Anti-A是鼠源IgG型，则同型对照抗体需要选择Mouse IgG

六、目前常见的几种分组方式：

1、内源性CO-IP检测

上面示意图分为两大部分：IP部分和Input部分。

首先看Input 部分，通过分别检测蛋白A和蛋白B表达水平，我们可以确认：

1组（IgG组）和2组（Anti-A组）中蛋白A、蛋白B均有表达，并且表达量一致，排除了因部分组别部分蛋白表达缺失、不同组蛋白表达量差异化大等原因造成的假阴性或者假阳性。

然后我们再看IP部分：

“IB:A”结果显示1组（IgG组）不结合蛋白A，2组（Anti-A组）可以特异性富集蛋白A。

“IB:B”结果显示IgG组没有非特异性结合，Anti-A组通过特异性富集蛋白A进而拉下蛋白B，即提示蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。

IP部分的“IB:A”这一步是关键的检测步骤，表明蛋白A已经通过免疫沉淀方法成功的特异性识别并富集到了磁珠/凝胶上，也就是说免疫沉淀的实验操作已成功。而下一步能否检测到蛋白B，主要是由两者是否存在互作决定的。如果蛋白表达量低，需要某种刺激条件等因素也会影响蛋白B能否被检测到.

2、外源性CO-IP检测

上图结果同样分为两大部分：IP部分和Input部分。外源性不需要设置IgG组（阴性对照），可以利用空载等方式设置阴性对照组。

Input部分通过分别检测HA和Flag表达水平，得出结果：

A-Flag和B-HA过表达后都能被检测到，并且表达量一致，排除了因样品量不均匀、样品组分缺失等原因造成的假阴性或者假阳性。

IP部分：“IB:Flag”结果显示1、3组通过IP:Flag可以特异性识别Flag标签并富集蛋白A。“IB:HA”结果显示1、2对照两组没有拉下蛋白B，第3组通过特异性富集蛋白A进而捕获蛋白B，即表面蛋白A和蛋白B可形成复合物，存在互作。

“IP:Flag、IB:Flag”这一步也是为了明确免疫沉淀特异性识别并利用磁珠/凝胶富集蛋白A的实验过程是成功的。