IF 14.7| BioTNT助力生物医学研究：CDK9通过招募HUWE1降解RARα为皮肤T细胞淋巴瘤提供治疗新策略
2024年12月，上海交通大学医学院附属瑞金医院在国际期刊《nature communications》上发表的，题为“CDK9 recruits HUWE1 to degrade RARα and offers therapeutic opportunities for cutaneous T-cell lymphoma”的论文。Chen-Hui Luo,Li-Hong Hu,Jie-Yang Liu,Li Xia同位第一作者，Meng-Ying Yang, Xue-Hong Zhang, Xiao-Bao Yang, Guo-Qiang Chen, Ying Lu为通讯作者。
背景：皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是一种非霍奇金淋巴瘤，早期主要局限于皮肤。随着疾病进展，局部皮肤恶性T细胞可发生系统性播散，侵入血液、淋巴结及内脏器官。早期惰性病变患者可通过局部皮肤靶向治疗有效控制，但晚期或难治性患者需接受系统性治疗，包括化疗、类视黄醇类似物、干扰素、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂及抗体疗法。然而，现有疗法均无法根治疾病，多数患者面临复发。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）家族为丝氨酸/苏氨酸激酶，其活性依赖于与细胞周期蛋白（cyclin）的结合。目前已发现20余种CDK家族成员，功能涵盖细胞周期调控（CDK1、2、4、6）及转录调控（CDK7、8、9、12、13、19）。与细胞周期相关CDK不同，转录相关CDK可与cyclin组成稳定复合体，并作为大型染色质复合物的组分被募集至特定基因位点。研究表明，抑制CDK9可通过转录抑制及下调促癌基因（如MYC）和抗凋亡基因（如MCL1）显著诱导癌细胞凋亡。CDK9靶向策略已在急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤及急性髓系白血病等血液肿瘤中展现出治疗潜力。尽管多种癌细胞依赖CDK9相关转录活性，但CDK9抑制剂的临床试验因疗效短暂及显著毒性而受限。此外，CDK9基因敲除与药物抑制导致的基因表达谱差异，提示CDK9靶向策略需更精准的应用。
研究信息: 本研究首次将CDK9鉴定为CTCL的分子弱点，并设计出体内高效的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）化合物以特异性杀伤CTCL细胞。更重要的是，我们发现CDK9通过招募E3泛素连接酶HUWE1（含HECT、UBA及WWE结构域的E3泛素连接酶1）介导视黄酸受体α（RARα）的泛素化降解。CDK9的缺失导致RARα累积，从而增强CTCL细胞对ATRA的敏感性。联合应用CDK9降解剂与激活RARα转录活性的ATRA可协同抑制肿瘤生长，为CTCL的根治提供了潜在治疗策略。
使用产品：
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L-1009
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1 mL
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共免疫沉淀（Co-IP）
细胞经过收集后，使用含有1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合液（BioTNT，L-1009）的NP-40裂解缓冲液（Beyotime，P0013F）进行裂解。经过超声处理后，将上清液（全细胞裂解液）在4°C下以20,000×g的速度离心10分钟，然后分别与抗Flag M2亲和纯化抗体（Sigma-Aldrich，M8823）或抗HA磁性琼脂糖珠（BioTNT，L-1009）孵育，用于免疫沉淀Flag或HA标记的蛋白。随后，将试管在4°C下轻微旋转过夜，然后使用磁性分离器分离上清液。对于RARα的共免疫沉淀（Co-IP），细胞经过收集后，使用含有1 mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂混合液（BioTNT，L-1009）和50 µM PR-619（MedChemExpress，HY-13814）的NP-40裂解缓冲液（Beyotime，P0013F）进行裂解。经过蛋白A/G琼脂糖珠（Santa Cruz，CA，sc-2003）预处理后，将上清液与RARα抗体在4°C下孵育过夜，然后与蛋白A/G琼脂糖珠子在4°C下孵育4小时。所有沉淀物均用NP-40裂解缓冲液洗涤三次，并在1×上样缓冲液中煮沸后进行Western blot分析。
变性泛素化实验
293T细胞经过10 µM蛋白酶体抑制剂MG132处理6小时后，收集细胞并使用变性裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS）在100°C下煮沸20分钟进行裂解，以破坏蛋白质之间的相互作用。随后，将裂解后的细胞在10°C下以20,000×g的速度离心10分钟，取上清液140 µL，用含有1 mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合液（BioTNT，L-1009）的NP-40裂解缓冲液1.26 mL稀释后，使用抗HA磁性琼脂糖珠（BioTNT）进行免疫沉淀。最后，通过Western blot分析检测多泛素化蛋白条带。
结果：
CDK9抑制RARα蛋白的表达，并且与RARα存在物理性相互作用。a Hut78细胞经23（GT-02897）处理后的定量蛋白质组学分析及火山图，P值通过Wilcoxon秩和检验得出。b经23（GT-02897）处理的Hut78细胞中指定蛋白的Western blot检测。c HH和Hut78细胞经慢病毒介导的CDK9耗竭后，指定蛋白的Western blot分析。d 293T细胞经慢病毒介导的CDK9耗竭后，指定蛋白的Western blot分析。e HH和Hut78细胞应用了强力霉素（Dox）诱导的敲低系统，随后进行Western blot检测。f CDK9耗竭后Hut78细胞中差异表达基因的火山图，P值通过Wilcoxon秩和检验得出。g CDK9耗竭后Hut78细胞中CDK9和RARA水平的Q-PCR检测。h CDK9耗竭后，Hut78细胞中蛋白的Western blot分析，有无MG132处理。i 293T细胞共转染RARα和CDK9构建物后，进行共免疫沉淀（Co-IP）和Western blot分析。j 用GST标记的CDK9与293T细胞全细胞裂解液（WCL）中的HA-RARα孵育，随后进行GST拉下和Western blot分析。WCL：全细胞裂解液。k全长CDK9蛋白的示意图（上）。用GST标记的CDK9和转染了3×HA标记的RARα的293T细胞的WCL进行GST拉下实验。l Hut78细胞经慢病毒介导的shNC或shCDK9-1感染后，转染EV、3×Flag标记的野生型（WT）、T186A和S347A的CDK9，并进行Western blot检测指定蛋白。m CDK9耗竭或Flavopiridol处理后Hut78细胞中指定蛋白的Western blot检测。n Flavopiridol处理的Hut78细胞中RARA的Q-PCR分析。o全长RARα蛋白的示意图（上）。在293T细胞中共转染3×Flag标记的CDK9与全长或突变型RARα构建物，随后进行Co-IP和免疫印迹（下）。g和n中的结果代表生物学独立实验的n=3，P值通过双尾Student’s t检验计算。数据以均值±标准误（SEM）表示，源数据以源数据文件形式提供。b至e、h至m、o中的n=3，独立实验，展示了一个代表性例子。每个实验的样本分别处理，但CDK9、β-actin和RARα（b、d、e、h）、RARα、β-actin和CDK9（c）、HA-RARα、β-actin和Flag-CDK9（i）、RARα、β-actin和Flag-CDK9（l）分别使用了不同的凝胶。b至e、h、l、m中的条带强度通过Image J分析并比较。相对光密度值在印迹图像下方提供。
CDK9招募HUWE1 E3泛素连接酶，触发RARα在K360位点的泛素化。a Hut78细胞转染了3×Flag标记的野生型（WT）、T186A或S347E突变型CDK9，随后使用抗Flag抗体进行共免疫沉淀（Co-IP）。以小鼠IgG作为阴性对照。样本通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，并列出了与3×Flag标记的WT、T186A或S347E CDK9相互作用的E3泛素连接酶。b 体外表达的GST标记的CDK9与Hut78细胞全细胞裂解液（WCL）孵育，随后进行GST拉下实验和Western blot分析。WCL：全细胞裂解液。c-e对Hut78（c）和293T（d）细胞进行HUWE1耗竭后的Western blot分析，以及在野生型（WT）和HUWE1敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（e）中指定蛋白的Western blot分析。f过表达RARα的Hut78细胞感染了shNC或shHUWE1慢病毒。在10 µM MG132或DMSO处理6小时后，进行抗RARα或小鼠IgG的共免疫沉淀（Co-IP），随后进行免疫印迹分析。g 在转染了3×HA标记的RARα、Myc标记的泛素和HUWE1的293T细胞中，在10 µM MG132或DMSO处理后，进行共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹分析。h RARα泛素化K位点的示意图（左侧）以及RARα配体结合域（LBD，白色）与ATRA（蓝色）结合的蛋白结构（PDB ID：3A9E）（右侧）。串联质谱图证实了RARα衍生肽段在K360位点的泛素结合。i 串联质谱图证实了RARα衍生肽段在K360位点的泛素结合。j 在293T细胞中共转染了野生型或突变型RARα（HA-RARαWT、HA-RARαK244R和HA-RARαK360R）以及Myc标记的泛素，并且在有无感染HUWE1的情况下进行实验。在10 µM MG132处理6小时后，进行共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹分析。k在293T细胞中共转染了野生型或突变型RARα（缺失Hinge结构域的HA-ΔH-RARαWT、HA-ΔH-RARαK244R和HA-ΔH-RARαK360R）以及Myc标记的泛素，并且在有无感染HUWE1的情况下进行实验。在10 µM MG132处理6小时后，进行共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹分析。l 对野生型（WT）和HUWE1敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行Western blot分析，检测指定蛋白的表达，这些细胞在有无感染3×Flag标记的CDK9的情况下进行实验。b至g以及j至l的实验均为独立实验，n=3，展示了一个代表性例子。每个实验的样本分别处理，但RARα、β-actin、HUWE1和GST-CDK9、GST（b）、RARα、β-actin和HUWE1（c至e）、RARα、β-actin和Ub（f）、HA-RARα、β-actin、HUWE1和Myc（g、j、k）、RARα、β-actin、Flag-CDK9和HUWE1（l）分别使用了不同的凝胶。c至e、l中的条带强度通过Image J分析并比较。相对光密度值在印迹图像下方提供。
CDK9与RARα的相互作用以及CDK9的定量磷酸化蛋白质组学分析a构建了RARα（3×HA标记）和CDK9（42 kDa）（3×Flag标记，野生型、S347E或S347A）的质粒，并将其共转染到293T细胞中。使用抗HA磁性珠子进行共免疫沉淀（Co-IP），随后对指定蛋白进行Western blot分析。n=3，独立实验，展示了一个代表性例子。样本来自同一实验，但Flag-CDK9和HA-RARα、β-actin分别使用了不同的凝胶进行处理。b 在用Flavopiridol处理或转染3×Flag标记的野生型CDK9的Hut78细胞中进行定量磷酸化蛋白质组学分析。分析了在CDK9过表达组中磷酸化上调且在Flavopiridol处理下被抑制的蛋白，以确定最富集的通路。
结论：开发针对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的靶向治疗存在迫切的临床需求。然而，由于对疾病潜在机制和异质性的理解不足，目前尚未开发出有效的靶向治疗策略。在本研究中，我们确定了CDK9是CTCL细胞的一个强效驱动因子，能够促进细胞生长。此外，我们还揭示了CDK9对RARα的激酶独立调控机制。通过揭示CDK9-RARα的调控关系，我们还解答了关于ATRA在CTCL中作用机制的长期问题。这些发现扩展了CDK9和RARα在细胞信号传导和癌症发展中的作用。总之，我们的研究揭示了CDK9在磷酸化RNA聚合酶II之外的作用，即通过CDK9-HUWE1-RARα轴诱导RARα的降解。此外，我们提出了将CDK9-PROTAC与ATRA联合用于CTCL治疗的协同疗法，为CTCL的临床根治提供了具有转化潜力的治疗选择。