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技术宝典— qPCR
qPCR 引物篇 03 ------ 通过序列比对确定引物特异性

引物从文献中得到后,或者由公司提供得到后,比较稳妥的方式是在ncbi网站上对上游和下游引物分别进行Blast分析,以确定该对引物是否特异扩增靶基因,而且不会扩增非靶基因。

 

具体方法是:

 

进入ncbiblast 网站:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

选择nucletide blast,点击进入:

 

也可直接点击:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

 

在框里复制上游引物,和下游引物;中间用分行符隔开;


 

如果你比对的是mRNA序列, 选择 reference RNA sequencerefseq-rna);


 

如果是其他序列,分别选择;如果不确定是什么,选择nucletide collection(这是最大的一个库);

 

点击下方的blast按钮;


 

会跳出如下界面:

 

判断原则:

 

一般来说,多少都会找到一些其他基因的同源序列,此时,可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

 

1maxscore, 是和输入的引物长度有关的;一般40bp长度,完全匹配时大约在40左右;

2、完全匹配时,total score大约在80左右,如果totalscore 特别高,则说明该引物可能在这个序列上有多处匹配,重复性高,并不是好的引物;

3、设计的目的基因,query coverage 必须是100%;针对同种属的其他的基因,如果也列出来,则query coverage 越低越好;

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