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技术宝典— qPCR
qPCR 引物篇 01 ------ 普通PCR和qPCR引物的区别

普通PCR 和 qPCR 引物的设计原则有相同也有不同;

 
相同处:
         序列的查找是一致的;
         序列选取应在基因的保守区段;
         选取合适的扩增片段大小
         避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;
         避免引物自身形成环状发卡结构;
         Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;
         引物之间的TM相差避免超过2℃;
         引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;
 
不同处:
       Real time PCR 引物
         PCR 产物长度;real-time PCR要求在300bp以内,一般首选80-150bp 之间;
         多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物;
         目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物;
         相对电泳法,Real time PCR灵敏度比较高,对引物的要求更高,引物二聚体要少;熔解曲线要求单一产物;
         Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量,对扩增的效率有要求;对引物的二级结构要求高;
 
普通PCR 引物:
         根据实验的要求不同,长度一般是从150bp到几千bp 不等;
         对二级结构要求没有real time PCR 高;
         对扩增效率要求不高;
         可以选用梯度PCR 仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致;
 
验证时不同:
 
引物的特异性(相同点):
Ø       引物的特异性在使用前用blast 来保证;
 
不同点:real time PCR
Ø       在实验结果中通过熔解曲线来验证;
Ø        PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内;
 
普通PCR 通过产物的长度,跑条带,来鉴别产物的特异性;
 
Real time PCR 可以通过扩增曲线,熔解曲线分析来鉴别产物的相对量,同时也可以对终产物进行电泳分析,更全面,更科学!
 
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