raybiotech  AAH-GF-G1芯片操作流程

（参见英文protocol）

1．实验材料及试剂

1.1 AAH-GF- G1试剂盒，试剂盒包含内容：

•        玻片芯片---（RayBio® Human  Growth Factor G1 Microarray slides (1个玻片上有4个或者8个阵列)

•        生物素标记抗体---（Biotin-Conjugated Anti-cytokines，4个阵列配1管，8个阵列配2管）

•        1500×荧光标记链霉亲和素­­---（Cy3 equivalent，1管）

•        1X封闭缓冲液---（Blocking Buffer, 30ml)

•        20X的洗液I ---（20X Wash Buffer I，30 ml)

•        20X 的洗液II---（20X Wash Buffer II, 30 ml)

•        2X细胞裂解液---（2X Cell Lysis Buffer，10ml）

•        玻片芯片配件--（玻片框架、垫圈、搭扣边、密封条）

•        30ml管---（tube）

•        操作手册

1.2 所需除试剂盒以外的材料及仪器：

•        塑料离心管(2-5ml，50ml)

•        摇床

•        塑料保鲜膜

•        双蒸馏水

•         Genepix荧光扫描仪

•         Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机

1.3 样品：

8个细胞上清

2 、实验步骤

2.1  玻片芯片的完全干燥

 将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

2.2  封闭和孵育

    1 每个芯片孔中加入100µL的1×封闭液，室温摇床上孵育30min，避免产生气泡；

 2抽去封闭液，每个孔中添加100µL样品（原液），一个阵列一个样品；(4 ℃振荡过夜孵育。样品离心13000rpm,8min)

3 使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250µL的1×洗液I，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250µL的1×洗液II，清洗5次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。

4配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入300µL的1×封闭液，混合均匀。每孔加入70µL生物素标记抗体；

5清洗，同步骤3).

6 每孔加入70µL的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素 （快速离心后加入1.5mL的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管），用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1-2个小时。（此步也可在4℃过夜孵育）

7 清洗，同步骤3).

2.3 荧光检测

采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号， 采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）

1） 扫描仪器： GenePix 4000B Microarray Scanner  

2） 产地：MoLecµLar Devices, LLC；1311 OrLeans Drive SunnyvaLe, CA 94089-1136 United States

3） 扫描参数：PMT: 650, WaveLengh：532nm； resoLution：10um

  采用芯片分析软件提取数据，采用AAH-GF-G1的数据分析软件来进行数据分析。

实验注意事项

A 玻片的操作

1)        不能触摸玻片的表面，因为玻片芯片非常灵敏，只能接触玻片的边缘；

2)        操作实验时候，请戴上橡胶手套（不掉粉末），以免污染试剂和玻片；

3)        避免打碎玻片

4)  保持实验操作环境整洁；

B 孵育

1)        样品和试剂孵育过程中，保证完全覆盖住玻片，且不能使玻片干燥

2)        孵育过程中避免产生气泡

3)        孵育过程和清洗过程保持在摇床上轻摇

4)        在孵育过程中，用密封条将玻片芯片封闭，尤其是当孵育时间超过2个小时，或者样品、试剂的体积小于70µL的时候。

5)        避免附近孔的交叉污染，邻近孔的液体避免溢出污染。

6)        封闭、样品孵育、检测抗体孵育、Cy3-链霉亲和素孵育都可以在4℃孵育过夜，但是请务必封闭玻片芯片非常严密，以免液体蒸发；