Rat T4 ELISA Kit

大鼠总甲状腺素酶联免疫试剂盒

用于大鼠血清，抗凝血浆中

总甲状腺素的检测

货号：A1010A0604  (96 wells)

仅供科研使用，勿用于药物、临床检测

联系地址：上海市徐汇区银都路398号1号楼5楼，

邮编：200231

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1.检测原理：

T4 ELISA试剂盒是一种固相酶联免疫吸附试验（ELISA），基于竞争性结合原理。

微孔板上包被有多克隆山羊-大鼠抗体。标准品、对照品和血清与含有单克隆抗T4抗体的检测试剂一起孵育。在接下来与结合剂的孵育过程中，样本的内源性T4与T4-辣根过氧化物酶结合剂竞争有限的结合位点。孵育后，未结合的结合物被洗掉。结合的过氧化物酶共轭物的数量与样品中T4的浓度成反比。加入底物溶液后，显色的强度与样品中T4的浓度成反比。

2.背景：

3，5，3′，5′四碘甲状腺原氨酸，即甲状腺素(Thyroxine，T4)。甲状腺素是甲状腺分泌最多的一种激素，在血液中的浓度比T3高30-60倍，是T3的主要来源。在正常情况下，T4主要和甲状腺激素结合球蛋白(TBG)结合。TT4测定是甲状腺功能状态基本的体外实验之一。

3.试剂盒组份（2-8℃保存）

1、酶标板（coated wells），96 test，12X8，可分拆, 已经包被抗T4抗体的酶标板；

2、标准品（standards）系列，6只标准品，标准品A  浓度0nmol/l，0.5ml ；标准品B 浓度25nmol /l，0.5ml ；标准品C 浓度50nmol /l，0.5ml；标准品D浓度100nmol /l，0.5ml；标准品E浓度175nmol/l，0.5ml；标准品F浓度250nmol/l，0.5ml质控低值 0.5ml 1vial，质控高值 0.5ml 1vial；质控的结果，请参考QC 报告；

3、酶联物（Enzyme Conjugate HRP），12mL，1 vial；

4、40×浓缩洗涤液（Wash Buffer），30 mL，1 vial；

5、TMB 显色液，12mL，1 vial；

6、终止液（Stop Solution），14 mL，1 vial；

4.未提供的试剂、仪器和耗材：

1、单道或多道（8道或12道）移液器及移液器枪头：10-200μL和50-1000μL；

2、多道（8道或12道）移液器试剂存放槽；

3、EP管及试剂配置容器；

4、圆柱形量筒：100mL，200mL，500mL和1L；

5、可在450nm处进行读数的酶标仪；

6、洗瓶或自动洗板机；

7、蒸馏水或去离子水；

8、封板膜或板盖；

9、乳胶手套；

10、吸水纸；

5.注意事项：

1、为了成功地使用本试剂盒，用户应该对该试剂盒有一个全面的了解。只有严格和仔细地遵守所提供的说明，才能获得可靠的性能。

2、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

3、每次运行都必须建立一条校准器曲线。

4、对照组（包含在试剂盒中）应包括在每一次运行中，并落在既定的置信度范围内。

5、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

6、消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

7、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

8、在储存和温育时避免强光直接照射。

9、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。

10、标准孔及待测样本均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线，请合理安排预实验。

不能使用过期产品。

11、不要使用严重溶血、严重脂血、贫血或储存不当的血清。

12、任何含有叠氮或硫柳汞的样品或对照血清都不能与本试剂盒兼容，因为它们可能导致错误的结果。

13、只有校准品A可用于稀释任何高血清样品。使用任何其他试剂都可能导致错误的结果。

14、在经常接触动物或动物产品的病人中出现的嗜异性抗体有可能对免疫学试验造成干扰。因此，如果怀疑出现错误结果，临床诊断应包括病人背景的所有方面，包括接触动物/产品的频率。

15、建议所有客户准备自己的对照材料或血清池，在每次运行中应包括高和低水平，以评估结果的可靠性。

16、当规定使用水进行稀释或重组时，请使用去离子水或蒸馏水。

17、为了减少对潜在有害物质的接触，在处理试剂盒试剂和大鼠标本时应戴上手套。

18、所有试剂盒的试剂和标本在使用前应达到室温并轻轻地但彻底地混合。避免反复冷冻和解冻试剂和标本。

19、当对照组的检测值不能反映既定范围时，可能表明程序技术不当，移液不准确，清洗不彻底以及试剂储存不当。

20、读取微孔板时，微孔中存在的气泡会影响光学密度（ODs）。在进行读数步骤之前，要小心地去除任何气泡。

21、底物溶液（TMB）对光敏感，如果保存得当，应保持无色。不稳定或污染可通过出现蓝色表示，在这种情况下不应使用。

22、在分配基质和停顿溶液时，不要使用这些液体会接触到任何金属部件的移液器。

为防止试剂污染，使用新的一次性移液器吸头来分装每个试剂、样品、标准品和对照品。

不要在一次测试中混合不同批号的试剂盒成分，不要使用超过标签上所印的有效期的任何成分。

23、试剂盒必须被视为危险废物，并按照国家规定进行处理。

6.安全性：

可能用于制备标准品和对照品的血清已经过测试，发现对乙肝表面抗原无反应，也已经过HCV和人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的测试，发现是阴性的。然而，没有任何一种测试方法可以完全保证不存在HIV、HCV和B型肝炎病毒或任何传染源。试剂应被视为潜在的生物危险，并以适用于任何血液标本的相同预防措施进行处理。

7.化学危害

避免与含有TMB、过氧化氢和硫酸的试剂接触。如果接触到这些试剂中的任何一种，请用大量水清洗。TMB是一种可疑的致癌物。

8.样本的采集：

1、 样本：本试剂盒可检测血清，抗凝血浆（EDTA，肝素锂血浆）

注意：含有叠氮化钠的样品不应用于检测。

一般来说，应避免使用溶血性或脂血性标本。

2、血清：

通过静脉穿刺采集血液（如用血清采集管），使之凝固，并在室温下通过离心分离血清。在完全凝固之前不要进行离心分离。接受抗凝血剂治疗的捐赠者可能需要增加凝血时间。

3、抗凝血浆：

全血应收集到含有抗凝血剂的离心管中，收集后立即离心。

4、标本的储存和准备

标本应加盖，在检测前可在2°C至8°C下储存48小时。保存时间较长（一个月内）的标本在检测前应仅在- 20℃下冷冻一次。更长时间的样本请-60到-80度保存。

5、标本稀释

大鼠血清，抗凝血浆，初次检测，推荐不稀释；

如果在初次检测中，发现标本的含量超过了最高标准，可以用标准A稀释标本，并按照检测程序中的描述重新进行检测。

在计算浓度时，必须考虑到这个稀释系数。

举例：

a) 稀释1:10：10微升样品+90微升标准A（充分混合）

b) 稀释1:100：10微升稀释液 a) 1:10 + 90微升标准A（充分混合）

9.试剂准备：

1×洗涤液配制：用蒸馏水1：40倍稀释（示例：1mL 40×浓缩洗涤液加入39mL蒸馏水,30ml  40×浓缩洗涤液加入1170mL蒸馏水）；

10.操作步骤：

1.      配置1x洗涤液（例：1ml 40x洗涤液加入 39ml 蒸馏水。）配置好待用，随后取出所需数量的微孔条。将任何未使用的条带放回密封袋子封闭并放冰箱。

2.      将所需数量的微滴孔固定在框架支架上。加样：将每种标准品、对照品和样品每孔加入10ul。封板在室温（18°C - 25°C）下孵育5分钟。

3.      将100 μL 酶偶联物分配到每个孔中。充分混合 10 秒钟。封板在室温（18°C - 25°C）下孵育80分钟。

4.      撕开封板膜，迅速地甩出孔内的液体。用稀释的洗涤溶液（每孔 400 μL）冲洗孔 5 次。甩去洗涤液后，将板倒贴在吸收纸上猛烈地打击去除孔内残留液滴。

5.      每孔加入显色工作液100μL

在室温（18°C - 25°C）下孵育10分钟

在室温（26°C - 29°C）下孵育7分钟

在室温（超过29°C）下孵育5分钟

6.      每孔加入100μL终止液，混匀；

7.  用微量滴定板读数器在450-630nm处测定每个孔的吸光度（OD）。建议在添加终止溶液后10分钟内读取孔。

11.结果计算与判断：

1.     计算每组标准品、对照品和样品的平均光密度（OD）值。

2.     使用半对数图画纸，通过将每个标准品获得的平均OD值与它的浓度绘制成标准曲线，OD值在垂直（Y）轴上，浓度在水平（X）轴上。

3.     使用每个样品的平均OD值确定标准曲线的相应浓度。

4.     自动方法：使用说明中的结果是使用4参数曲线拟合自动计算的 。可以采用logistic曲线拟合（ 4参数）拟合的方式，也可以采用logit-log的拟合方式。两者的数据拟合结果可能会得到略有不同的结果。

5.     样品的浓度可以直接从这个标准曲线中读取。浓度高于最高标准的样品必须进一步稀释或报告为>250nmol/l。在计算浓度时，必须考虑到这个稀释系数。

12.典型标准曲线示例

 
以下为logistic直线拟合（ 4参数）拟合的示意图：

13.试剂盒特性：

13.1试剂盒定量范围：

本试剂盒的定量范围为：8-250nmol/ml

13.2试剂盒灵敏度（Sensitivity）：

试剂盒ELISA的分析灵敏度，确定是8.0 nmol//ml.

13.3特异性（交叉反应性）

13.4 高剂量hook效应

本竞争性试验中不存在高剂量-hook效应。