Mouse Testosterone ELISA Kit

小鼠睾酮酶联免疫试剂盒

用于小鼠血清，抗凝血浆中

睾酮的检测

货号：A1010A0505  (96 wells)

仅供科研使用，勿用于药物、临床检测

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1.检测原理：

Testosterone（睾酮） ELISA试剂盒是一种固相酶联免疫吸附试验（ELISA），基于竞争性结合原理。微孔板上包被有多克隆山羊-小鼠抗体。标准品、对照品和血清与含有单克隆抗睾酮抗体的检测试剂一起孵育。在接下来与结合剂的孵育过程中，样本的内源性睾酮与睾酮-辣根过氧化物酶结合剂竞争有限的结合位点。孵育后，未结合的结合物被洗掉。结合的过氧化物酶共轭物的数量与样品中睾酮的浓度成反比。加入底物溶液后，显色的强度与样品中睾酮的浓度成反比。

2.背景：

睾酮是人体内最主要的雄激素，主要由睾丸间质细胞合成，肾上腺可分泌雄激素。此外，女性卵巢也可分泌少量雄激素。血液中的绝大部分睾酮可与血浆蛋白结合，仅有少数以游离形式存在。游离的睾酮才具有生物活性。睾酮的主要生理作用为促进生殖器官的发育和生长，刺激性欲，同时，促进和维持男性第二性征的发育，维持前列腺和精囊的功能和生精作用。此外，其还可促进蛋白质合成、骨骼生长以及红细胞生成。该指标可用于评估睾丸雄激素分泌功能。

3.试剂盒组份（2-8℃保存）

1、酶标板（coated wells），96 test，12X8，可分拆, 已经包被睾酮抗体的酶标板；

2、标准品（standards）系列，6只标准品，标准品A  浓度0ng/ml，0.3ml ；标准品B 浓度0.1ng /ml，0.3ml ；标准品C 浓度0.4 ng/ml，0.3ml；标准品D浓度1.5ng /ml，0.3ml；标准品E浓度6.0ng/ml，0.3ml；标准品F浓度25ng/ml，0.3ml。

3、培养缓冲液（Incubation Buffer）,11ml，1 vial；

4、酶联物（Enzyme Conjugate HRP），7mL，1 vial；

5、10×浓缩洗涤液（Wash Buffer），50 mL，1 vial；

6、TMB 显色液，22mL，1 vial；

7、终止液（Stop Solution），7 mL，1 vial；

4.未提供的试剂、仪器和耗材：

1、单道或多道（8道或12道）移液器及移液器枪头：10-200μL和50-1000μL；

2、多道（8道或12道）移液器试剂存放槽；

3、EP管及试剂配置容器；

4、圆柱形量筒：100mL，200mL，500mL和1L；

5、可在450nm处进行读数的酶标仪；

6、洗瓶或自动洗板机；

7、蒸馏水或去离子水；

8、封板膜或板盖；

9、乳胶手套；

10、吸水纸；

5.注意事项：

1、为了成功地使用本试剂盒，用户应该对该试剂盒有一个全面的了解。只有严格和仔细地遵守所提供的说明，才能获得可靠的性能。

2、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

3、每次运行都必须建立一条校准器曲线。

4、对照组（包含在试剂盒中）应包括在每一次运行中，并落在既定的置信度范围内。

5、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

6、消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

7、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

8、在储存和温育时避免强光直接照射。

9、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。

10、标准孔及待测样本均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线，请合理安排预实验。

不能使用过期产品。

11、不要使用严重溶血、严重脂血、贫血或储存不当的血清。

12、任何含有叠氮或硫柳汞的样品或对照血清都不能与本试剂盒兼容，因为它们可能导致错误的结果。

13、只有校准品A可用于稀释任何高血清样品。使用任何其他试剂都可能导致错误的结果。

14、在经常接触动物或动物产品的病人中出现的嗜异性抗体有可能对免疫学试验造成干扰。因此，如果怀疑出现错误结果，临床诊断应包括病人背景的所有方面，包括接触动物/产品的频率。

15、建议所有客户准备自己的对照材料或血清池，在每次运行中应包括高和低水平，以评估结果的可靠性。

16、当规定使用水进行稀释或重组时，请使用去离子水或蒸馏水。

17、为了减少对潜在有害物质的接触，在处理试剂盒试剂和人体标本时应戴上手套。

18、所有试剂盒的试剂和标本在使用前应达到室温并轻轻地但彻底地混合。避免反复冷冻和解冻试剂和标本。

19、当对照组的检测值不能反映既定范围时，可能表明程序技术不当，移液不准确，清洗不彻底以及试剂储存不当。

20、读取微孔板时，微孔中存在的气泡会影响光学密度（ODs）。在进行读数步骤之前，要小心地去除任何气泡。

21、底物溶液（TMB）对光敏感，如果保存得当，应保持无色。不稳定或污染可通过出现蓝色表示，在这种情况下不应使用。

22、在分配基质和停顿溶液时，不要使用这些液体会接触到任何金属部件的移液器。

为防止试剂污染，使用新的一次性移液器吸头来分装每个试剂、样品、标准品和对照品。

不要在一次测试中混合不同批号的试剂盒成分，不要使用超过标签上所印的有效期的任何成分。

23、试剂盒必须被视为危险废物，并按照国家规定进行处理。

6.安全性：

可能用于制备标准品和对照品的血清已经过测试，发现对乙肝表面抗原无反应，也已经过HCV和人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的测试，发现是阴性的。然而，没有任何一种测试方法可以完全保证不存在HIV、HCV和B型肝炎病毒或任何传染源。试剂应被视为潜在的生物危险，并以适用于任何血液标本的相同预防措施进行处理。

7.化学危害

避免与含有TMB、过氧化氢和硫酸的试剂接触。如果接触到这些试剂中的任何一种，请用大量水清洗。TMB是一种可疑的致癌物。

8.样本的采集：

1、 样本：本试剂盒可检测血清，抗凝血浆（EDTA，肝素锂血浆）

注意：含有叠氮化钠的样品不应用于检测。

一般来说，应避免使用溶血性或脂血性标本。

2、血清：

通过静脉穿刺采集血液（如用血清采集管），使之凝固，并在室温下通过离心分离血清。在完全凝固之前不要进行离心分离。接受抗凝血剂治疗的捐赠者可能需要增加凝血时间。

3、抗凝血浆：

全血应收集到含有抗凝血剂的离心管中，收集后立即离心。

4、标本的储存和准备

标本应加盖，在检测前可在2°C至8°C下储存48小时。保存时间较长（一个月内）的标本在检测前应仅在- 20℃下冷冻一次。更长时间的样本请-60到-80度保存。

5、标本稀释

小鼠血清，抗凝血浆，初次检测，推荐不稀释；

如果在初次检测中，发现标本的含量超过了最高标准，可以用标准A稀释标本，并按照检测程序中的描述重新进行检测。

在计算浓度时，必须考虑到这个稀释系数。

举例：

a) 稀释1:10：      10微升样品+90微升标准A（充分混合）

b) 稀释1:100：10微升稀释液 a) 1:10 + 90微升标准A（充分混合）

9.试剂准备：

1×洗涤液配制：用蒸馏水1：10倍稀释（示例：1mL10×浓缩洗涤液加入9mL蒸馏水,30ml  10×浓缩洗涤液加入270mL蒸馏水）；

10.操作步骤：

1.      完成9.试剂准备。

2.      将所需数量的微滴孔固定在框架支架上。加样：每孔加入相对应标准品、对照、待测样品各10μL，彻底混合10秒钟。充分混匀。

3.      每孔加入100ul 培养缓冲液，再加50 ul酶联物（Enzyme Conjugate），彻底混合10秒钟。封板，充分混匀，温育60分钟；

4.      洗板：用1×洗涤液 每孔加入300ul，反应板每孔加入300ul洗涤液反复充分洗涤3次后在吸水纸上拍干。

5.      每孔加入显色工作液200μL，将反应板置暗处室温10分钟（可以目测实际显色情况，如显色过深，请及时终止）；

6.      每孔加入50μL终止液，混匀；

7.      设置酶标仪主波长450nm副波长630nm检测吸光度，终止后在10分钟内读数。

注：如果OD超过检测上限或450nm滤光片不可用，则405或415nm滤光片可能

被替换。光学密度会更低，但这不会影响患者/对照的结果。

11.结果计算与判断：

1.     计算每组标准品、对照品和样品的平均光密度（OD）值。

2.     使用半对数图画纸，通过将每个标准品获得的平均OD值与它的浓度绘制成标准曲线，OD值在垂直（Y）轴上，浓度在水平（X）轴上。

3.     使用每个样品的平均OD值确定标准曲线的相应浓度。

4.     自动方法：使用说明中的结果是使用4参数曲线拟合自动计算的 。可以采用logistic曲线拟合（ 4参数）拟合的方式，也可以采用logit-log的拟合方式。两者的数据拟合结果可能会得到略有不同的结果。

5.     样品的浓度可以直接从这个标准曲线中读取。浓度高于最高标准的样品必须进一步稀释或报告为>16 Ing/ml。在计算浓度时，必须考虑到这个稀释系数。

12.典型标准曲线示例

以下为logistic直线拟合（ 4参数）拟合的示意图：

13.试剂盒特性：

13.1特异性（交叉反应性）

用睾酮交叉反应为100%的直接睾酮ELISA试剂盒测试下列化合物的交叉反应性。

13.2试剂盒数据批内差（Intro-Assay）：

分析内变异性如下所示：

13.3试剂盒数据批间差（Inter-Assay）：

分析内变异性如下所示：

13.4试剂盒灵敏度（Sensitivity）：

试剂盒ELISA的分析灵敏度，确定是0.066ng//ml.

13.5高剂量hook效应

本竞争性试验中不存在高剂量-hook效应。