大鼠二氢睾酮酶联免疫试剂盒
用于大鼠体外定量诊断
血清或血浆中的二氢睾酮
货号：A1010A0608 96 wells
仅供科研使用，勿用于药物、临床检测
联系地址：上海市徐汇区银都路398号1号楼5楼，邮编：200231
联系电话：86 21 51692391，4008801880
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1.检测原理：
DHT ELISA是一种竞争性免疫测定方法。存在于标准品、对照品和患者样品中的二氢睾酮与酶标记抗原(偶联物)之间发生竞争，争夺微孔上有限数量的抗二氢睾酮抗体结合位点。经过去除未结合物质的洗涤步骤后，加入酶底物，30分钟后通过添加停止溶液终止酶促反应。由此产生的光密度(OD)，用微孔板读取器测量，与样品中DHT的浓度成反比。用提供的一组标准品绘制标准曲线，直接计算患者样品和对照中DHT的浓度。
2.背景：
二氢睾酮亦称17β－羟基-5α-雄[甾]烷-3-酮、5α－二氢睾酮、5α－DHT、或雄烷酮（stanorone）。是睾酮的双键在5α处被还原的甾醇。对附属腺（前列腺、精囊腺等），起着所谓的真的雄性激素的作用。在附属性腺的细胞中存在着形成该甾醇的5α-氢化酶。该甾醇和受体蛋白质在细胞内结合成的复合体进入附属腺的细胞核中，促进新的蛋白质合成。显示出比睾酮稍强的雄性激素作用。5β-体虽在肝脏、鸡冠等中以睾酮形态存在，但是没有雄性激素的作用。5α－二氢睾酮由于3α-羟基甾醇脱氢酶的作用而代谢成为5α-雄烷-3α－17β-二醇排出体外。
3.试剂盒组份（2-8℃保存）
1. 酶标板（coated wells），96 test，12X8，可分拆, 已经包被抗二氢睾酮抗体的酶标板；
2. 标准品（standards）系列，6只标准品，标准品A 浓度0 pg/ml，2ml ；标准品B 浓度25pg/ml，0.6ml ；标准品C浓度100pg /ml，0.6ml；标准品D浓500 pg/ml，0.6ml；标准品E浓度1000 pg/ml，0.6ml；标准品F浓度2500 pg/ml，0.6ml； 质控1，0.6ml；质控2，0.6ml；质控的结果，请参考QC 报告；
3. 样品稀释液(Assay Buffer) ，15mL，1 vial；
4. HRP (DHT-Horseradish Peroxidase Conjugate 100X) ，200μL，1 vial；
5. 10×浓缩洗涤液（Wash Buffer），50 mL，1 vial；
6. TMB 显色液，16mL，1 vial；
7. 终止液（Stop Solution），6 mL，1 vial；
4.未提供的试剂、仪器和耗材：
1. 校准的微量滴定板读数器（450 nm，参考波长为620 nm至630 nm）
2. 校准的可变精度微量移液管
3. 吸水纸
4. 计时器
5. 用于数据缩减的半对数图形纸或软件
6. 多道（8道或12道）移液器试剂存放槽；
7. EP管及试剂配置容器；
8. 圆柱形量筒：100mL，200mL，500mL和1L；
9. 洗瓶或自动洗板机；
10. 蒸馏水或去离子水；
11. 封板膜或板盖；
12. 乳胶手套；
5.注意事项：
1. 此试剂盒仅供体外诊断使用。仅供专业人士使用。
2. 本试剂盒中所有含有大鼠血清或血浆的试剂均已检测确认通过美国食品药品监督管理局批准的程序对HIV I/II、HBsAg和HCV呈阴性。然而，所有试剂都应在使用和处置中被视为潜在的生物危害。
3. 在开始化验之前，请完整仔细地阅读说明书。使用的有效版本随试剂盒提供的使用说明。确保所有内容都被理解。
4. 微孔板包含可折断的条带。未使用的井必须在2°C至8°C的温度下储存在密封箔袋中，并在提供的框架中使用。
5. 样品和试剂的移液必须尽快完成，并按照相同的顺序进行每一步。
6. 每次运行都必须建立一条校准器曲线。
7. 对照组（包含在试剂盒中）应包括在每一次运行中，并落在既定的置信度范围内。
8. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
9. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
10. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
11. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
12. 在储存和温育时避免强光直接照射。
13. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。
14. 标准孔及待测样本均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线，请合理安排预实验。
15. 不能使用过期产品。
16. 不要使用严重溶血、严重脂血、贫血或储存不当的血清。
17. 任何含有叠氮或硫柳汞的样品或对照血清都不能与本试剂盒兼容，因为它们可能导致错误的结果。
18. 只有校准品A可用于稀释任何高血清样品。使用任何其他试剂都可能导致错误的结果。
19. 在经常接触动物或动物产品的病人中出现的嗜异性抗体有可能对免疫学试验造成干扰。因此，如果怀疑出现错误结果，临床诊断应包括病人背景的所有方面，包括接触动物/产品的频率。
20. 建议所有客户准备自己的对照材料或血清池，在每次运行中应包括高和低水平，以评估结果的可靠性。
21. 当规定使用水进行稀释或重组时，请使用去离子水或蒸馏水。
22. 为了减少对潜在有害物质的接触，在处理试剂盒试剂和大鼠标本时应戴上手套。
23. 所有试剂盒的试剂和标本在使用前应达到室温并轻轻地但彻底地混合。避免反复冷冻和解冻试剂和标本。
24. 当对照组的检测值不能反映既定范围时，可能表明程序技术不当，移液不准确，清洗不彻底以及试剂储存不当。
25. 读取微孔板时，微孔中存在的气泡会影响光学密度（ODs）。在进行读数步骤之前，要小心地去除任何气泡。
26. 底物溶液（TMB）对光敏感，如果保存得当，应保持无色。不稳定或污染可通过出现蓝色表示，在这种情况下不应使用。
27. 在分配基质和停顿溶液时，不要使用这些液体会接触到任何金属部件的移液器。
28. 为防止试剂污染，使用新的一次性移液器吸头来分装每个试剂、样品、标准品和对照品。
29. 不要在一次测试中混合不同批号的试剂盒成分，不要使用超过标签上所印的有效期的任何成分。
30. 试剂盒必须被视为危险废物，并按照国家规定进行处理。
6.安全性：
可能用于制备标准品和对照品的血清已经过测试，发现对乙肝表面抗原无反应，也已经过HCV和人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的测试，发现是阴性的。然而，没有任何一种测试方法可以完全保证不存在HIV、HCV和B型肝炎病毒或任何传染源。试剂应被视为潜在的生物危险，并以适用于任何血液标本的相同预防措施进行处理。
7.化学危害
避免与含有TMB、过氧化氢和硫酸的试剂接触。如果接触到这些试剂中的任何一种，请用大量水清洗。TMB是一种可疑的致癌物。
8.样本的采集：
每次重复测定大约需要0.1 ml血清。收集4-5毫升的血液到一个适当的标记管，让它凝结。离心并小心地除去血清层。在室温下保存7天，在2-8°C下保存14天，或在-20°C或以下冷冻长达1个月。将所有大鼠标本视为可能的生物危险材料，并在处理时采取适当的预防措施
9.试剂准备：
1×洗涤液配制：用蒸馏水1：10倍稀释（示例：1mL 10×浓缩洗涤液加入9mL蒸馏水,50ml 10×浓缩洗涤液加入450mL蒸馏水）；
1×Streptavidin-HRP Conjugate：用稀释液按1:100倍稀释100×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。
10.操作步骤：
1. 标本预处理:无。
2. 所有试剂盒组件，控制和样品样品必须在使用前达到室温。标准品、对照品和样品应一式两份。一旦程序开始，所有步骤应不间断地完成。
3. 将所需数量的微滴孔固定在框架支架上。加样：加入相对应标准品，对照品和待测样品各50μL，在每个孔中加入100µl1×Streptavidin-HRP Conjugate，彻底混合10秒钟。封板，充分混匀，室温温育60分钟；
4. 洗板：用1×洗涤液 每孔加入300ul，将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上拍干； 洗板很重要！
5. 每孔加入显色工作液150μL，将反应板置暗处室温10分钟（可以目测实际显色情况，如显色过深，请及时终止）；
6. 每孔加入50μL终止液，混匀；
7. 设置酶标仪主波长450nm副波长630nm检测吸光度，终止后在10分钟内读数。
11.结果计算与判断：
1. 计算每组标准品、对照品和样品的平均光密度（OD）值。
2. 使用半对数图画纸，通过将每个标准品获得的平均OD值与它的浓度绘制成标准曲线，OD值在垂直（Y）轴上，浓度在水平（X）轴上。
3. 使用每个样品的平均OD值确定标准曲线的相应浓度。
4. 自动方法：使用说明中的结果是使用4参数曲线拟合自动计算的 。可以采用logistic曲线拟合（ 4参数）拟合的方式，也可以采用logit-log的拟合方式。两者的数据拟合结果可能会得到略有不同的结果。
5. 样品的浓度可以直接从这个标准曲线中读取。浓度高于最高标准的样品必须进一步稀释或报告为>10 ng/ml。在计算浓度时，必须考虑到这个稀释系数