人脑源性神经营养因子酶联免疫试剂盒

Human BDNF ELISA Kit

用于血清，抗凝血浆，细胞上清及其他生物体液中

人脑源性神经营养因子的检测

货号：A1010A0191

96 tests

仅供科研使用，勿用于药物、临床检测

检测原理： 

本试剂盒采用双抗夹心法。用抗Human BDNF抗体包被于酶标板上，标准品和样本中的Human BDNF与单抗结合，加入生物素化的抗Human BDNF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液，在450nm处测OD值，Human BDNF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Human BDNF的浓度。

试剂盒组份（2-8℃保存）

1. Human BDNF酶标板（coated wells），12*8wells（单孔可折），1 plate；

2. Human BDNF 标准品10 ng（standards），10ng/ml 标准品，每支100μL，2 vial；

3. Human BDNF 120×生物素化二抗（Biotinylated Antibody），100μL，1 vial；

4. Human BDNF 300×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物（Streptavidin HRP Conjugate），100μL，1 vial；

5. 稀释液I（Assay Diluent I），30 mL，1 vial；

6. 稀释液 II（Assay Diluent II），12 mL，1 vial；

7. 稀释液 III（Assay Diluent III），12 mL，1 vial；

8. 20×浓缩洗涤液（Wash Buffer），30 mL，1 vial；

9. 显色液A（Color Reagent A），6 mL，1 vial；

10. 显色液B（Color Reagent B），6 mL，1 vial；

11. 终止液（Stop Solution），12 mL，1 vial；

12. 封板膜，3张；

未提供的试剂、仪器和耗材：

1. 单道或多道（8道或12道）移液器及移液器枪头：10-200μL和50-1000μL；

2. 多道（8道或12道）移液器试剂存放槽；

3. EP管及试剂配置容器；

4. 圆柱形量筒：100mL，200mL，500mL和1L；

5. 可在450nm处进行读数的酶标仪； 洗瓶或自动洗板机；

6. 蒸馏水或去离子水；封板膜或板盖；乳胶手套；吸水纸；

注意事项：

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发出来的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反映试剂的生物活性。

8. 标准孔及待测样本均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线，请合理安排预实验。

9. 不能使用过期产品。

样本与试剂准备：

1. 样本：本试剂盒可检测血清，血浆（EDTA，肝素抗凝），细胞培养上清液，组织匀浆等生物学样本。样本储存要求2-8℃保存48小时以内，更长时间需冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。如样本Human BDNF 含量过高，可用稀释液 I进行稀释。

2. 标准品配制：一只10ng/ml 标准品，每支100μL。混匀，离心，吸取 20ul 标准品，加入380ul的稀释液 I中，得到500pg/ml 浓度的标准品溶液（标准曲线最高点）；再准备六支空EP管，分别加入500μL稀释液I，吸取500pg/mL的标准品溶液200μL加入第一管中，充分混匀，从第一管中取200μL加到第二管中，充分混匀，如此反复对半稀释至浓度7.8pg/mL的标准品溶液；另取一空白EP管加入足量的稀释液I，设为空白对照。

3. 1×Biotinylated Antibody：用稀释液 II按1:120倍稀释120×生物素化二抗。

4. 1×Streptavidin-HRP Conjugate：用稀释液 III按1:300倍稀释300×亲和链霉素辣根过氧化物酶结合物。

5. 显色液配制：A液和B液做1：1配制，即配即用，可根据使用量临时配制（使用前15分钟内配制），不要配制过多的显色液。

6. 1×洗涤液配制：用蒸馏水1：20倍稀释（示例：1mL 20×浓缩洗涤液加入19mL蒸馏水）；

操作步骤：

血清样本推荐500倍稀释（正式实验前建议预实验确定您样本的稀释倍数）； 抗凝血浆样本需进行预实验确认稀释倍数；其他样本，如细胞上清，细胞裂解液，脑脊液，以及其他生物学样本均需要在正式实验前预实验确认稀释倍数；

酶标板是12*8wells的lockwell 形式，属于单孔可折形式，可以按照自己的需要每次拆下相应的板条来进行实验；如果第一次使用biotnt的这款试剂盒，建议您在进行大批量实验之前先进行预实验；血清样本建议稀释倍数20-200倍

预实验方式：选用1条酶标板，加入标准品500pg/ml ，7.8pg/ml，0孔；另外，再选择您待测的两个样本，第一个样本选择三个稀释梯度；第二个样本选择两个稀释梯度来进行预实验；

实验步骤：

1. 加样：加入相对应标准品100μL，加入待测样品100μL， 封板，充分混匀，37℃温育90分钟；

2. 洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤3次，在吸水纸上拍干；

3. 每孔加入已稀释1× Biotinylated Antibody 100μL，封板，室温温育60分钟；

4. 洗板：同第二步；

5. 每孔加1×Streptavidin- HRP 100μL，封板，室温温育30分钟；

6. 洗板：同第二步；

7. 每孔加入已配制的显色工作液100μL，将反应板置暗处室温5-15分钟，每隔一段时间，目测标准品和样本的板孔变为蓝色， 酶标仪620-630nm 进行读数并保存（第一次数据），标准品孔的最高点读数OD 值如果超过0.8，请及早终止。如果标准品最高点读数没有超过0.4，可以延长室温温育时间为30min，再进行下一步终止反应。

8. 每孔加入100μL终止液，混匀；如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

9. 在5分钟内进行酶标仪读数，设置双波读数（第二次数据），酶标仪主波长450nm，副波长620-630nm检测吸光度。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去 620-630 nm 的测定值。仅使用450 nm 测定会导致OD值偏高，并且准确度降低。

10. 如果酶标仪没有620-630nm的波长，也可以根据酶标仪的情况选择570-650nm的波长作为替代。

结果计算与判断：

1. 所有OD值都应减除空白值后再计算；先计算450-630nm的数据（第二次数据）；

2. 以标准品500，250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，0pg/mL为横坐标，450-630nm的OD值为纵坐标，画出标准曲线。

3. 根据样本OD值在该曲线图上查出相对应Human BDNF含量，如样本有稀释，请再乘上稀释倍数。如果样本没有进行预稀释，则稀释倍数为2 。计算出的数值应该乘以2。

4. 推荐采用双对数方式进行数据拟合。如下是示例数据：

Standard (pg/mL)	O.D. (450 nm-630nm)	Mean	Zero Standard Subtracted (Std.)-(S1)
500 pg/ml	2.314,2.222	2.2680	2.1100
250 pg/ml	1.763,1.768	1.7655	1.6075
125 pg/ml	1.191,1.18	1.1855	1.0275
62.5pg/ml	0.742,0.743	0.7425	0.5845
31.3pg/ml	0.482,0.48	0.4810	0.3230
15.6pg/ml	0.334,0.336	0.3350	0.1770
7.8pg/ml	0.249,0.25	0.2495	0.0915
0 pg/ml	0.159,0.157	0.1580	0.0000

  

5. 如果样本OD 值超过标准曲线的最高点， 使用第二次数据结果会不准确，我们采用第一次数据来进行数据计算；

样本第一次读数小于2.0 OD（630nm）的，可以用这个标准曲线进行计算，得到相对准确的结果； OD 如果超过2.0，建议样本稀释以后重新测定；

试剂盒数据批内差（Intra-Assay）：

选取不同浓度的血浆样本各3例在同一次验证实验中加样20孔，来验证批内差，检测结果如下：

试剂盒数据批间差（Inter-Assay）：

选取不同浓度的血浆样本各3例在10次不同的实验中进行检测，来验证批间差，检测结果如下：

试剂盒灵敏度（Sensitivity）：

本试剂盒检测Human BDNF的最低浓度为2.6pg/mL，验证实验选取两条标准品进行梯度稀释确认2.6pg/mL以上浓度的反应孔OD值呈正相关线性分布，BDNF浓度在2.6 - 7.8pg/mL之间样本可以被检测到但会有较大偏差，低于2.6pg/mL无法被检出。

试剂盒数据回归性（Recovery）：

选取血清、血浆、细胞上清等不同类型的人样本按低浓度、中浓度、高浓度分组稀释做回归性验证实验，将线性回归后的浓度值与理论浓度值相比较统计结果如下：

试剂盒数据特异性（Specificity）：

本ELISA试剂盒可以检测自然或重组Human BDNF蛋白。试剂盒与Mouse BDNF及Rat BDNF有交叉反应。