产品参数
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microRNA qRT-PCR Sybgreen Detection Kit
升级版一步法
Cat.A2010A0901 120 Tests
Cat.A2010A0901S 60 Tests
Contents and Storage（组分及贮存）（-20℃储存）
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PART A，Cat. A2010A0901PA，microRNA RT-RT PCR试剂盒染料法（茎环法不含引物）
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60T
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120T
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RT - PCR mix
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0.5 ml /vial 1Vial
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1 ml /vial 1Vial
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酶mix
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0.5 ml /vial 1Vial
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1 ml /vial 1Vial
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RNase-free ddH2O
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1.5 mL/vial 2 Vial
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1.5 mL/vial 2Vial
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PART B，BioTNT microRNA qPCR引物
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60T
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120T
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茎环引物（引物后缀为h）（20X）
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60 μL
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120 μL
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上游引物（引物后缀为f）（20X）
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60 μL
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120 μL
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下游引物（引物后缀为r）（20X）
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60 μL
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120 μL
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PART C，BioTNT microRNA qPCR 内参引物（赠送）
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60T
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120T
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茎环引物（引物后缀为h）（20X）
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60 μL
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120 μL
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上游引物（引物后缀为f）（20X）
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60 μL
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120 μL
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下游引物（引物后缀为r）（20X）
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60 μL
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120 μL
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Introduction（简介）
实验背景
microRNA，microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。成熟的microRNA 的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为pri-microRNA 的初级转录物；动物pri-microRNA的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为70个核苷酸左右并能形成茎-环结构的microRNA 前体，称为pre-microRNA；第二次剪切位于细胞质中，pre-microRNA被剪切成21-25个核苷酸成熟的microRNA。
试剂盒系统简介：
本试剂盒分为三部分，均可以单独订购。本试剂盒用于成熟的microRNA的逆转录和Real Time PCR实验。A2010A0901PA PART A microRNA RT-RT PCR试剂盒染料法（不含引物）可以单独订购。Cat.A2010A0901试剂盒可以完成120个样本的目的microRNA和内参RNU6 的逆转录和qPCR 实验（20ul体系）的单孔实验，或者10ul体系120个样本的目的microRNA和内参的双重复实验。如果要进行三重复检测，能检测的样本数量相应减少。Cat.A2010A0901S试剂盒能检测的数量相应减少。
产品使用限制
1. 本产品只用于分子生物学研究。其不应用于诊断、预防和治疗疾病。在使用本产品时应遵从相应的注意事项；
2. 本产品中部分试剂有腐蚀性或毒性，勿直接接触皮肤或吞咽；
3. 操作时请穿戴实验服和手套，如接触皮肤，应立即用大量清水冲洗；
4. 误食或其他危急情况，请及时到医院就治；
5. 部分试剂易燃，请注意消防安全。
实验原理
使用BioTNT 茎环系统microRNA Real Time PCR assay, 采用的是一步法RT-PCR：
1. 原来的第一步逆转录：使用试剂盒中提供的特异性的茎环逆转录引物和BioTNT 茎环系统逆转录试剂盒进行逆转录，得到CDNA；
2. 原来第二步Real Time PCR；
3. 升级版试剂盒采用了microRNA 专用一步法RT-qPCR mix（染料法），把两步合并为1步，仅需一次反应，就可以完成逆转录和qPCR实验，极大的降低了操作复杂程度，提高了试剂盒灵敏度。
Material & Methods（材料与方法）
客户自备设备和试剂
1. 已制备的总RNA样本；
2. 0.6mL及1.5mL Eppendorf管（无菌、无酶、RNase-free；货号A2010B0X04）；
3. RNase-free Tips（1000μL、200μL的枪头；货号A2010B0X09）；
4. 移液器（200μL，1000μL）；
5. 恒温水浴锅或金属浴，冰浴盒；
6. 12000g冷冻离心机；
7. Real Time PCR仪；
操作说明
一、逆转录+real time PCR步骤(PART A，货号为A2010A0901PA)：
1. 提前将试剂盒中试剂及总RNA样本放置冰浴，温度平衡至冰点；
2. 震荡混匀所有试剂及总RNA样本并瞬时离心；
3. 按下表配置反应体系，震荡混匀；提取好的总RNA加入DEPC水， 按照1：3进行稀释；稀释后的RNA作为待检RNA进行检测；按照下表配制两套；一套为 目的反应液， 一套为内参反应液；
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目的反应液组份
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内参反应液组份
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加量 (μl)
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终浓度
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备注
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RT - PCR mix
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RT - PCR mix
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4
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1X
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酶mix
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酶mix
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4
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1X
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目的上游引物（20X)
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内参上游引物（20X)
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1
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1X
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目的下游引物（20X)
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内参下游引物（20X)
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1
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1X
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目的茎环引物（20X)
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内参茎环引物（20X)
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1
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1X
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待检RNA
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待检RNA
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2-9
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用户自备
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DEPC H2O
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DEPC H2O
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补足
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总体积
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20ul
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总RNA 中应含有小RNA(small RNA)；总RNA的量应在0.1至5 μg之间；如果采用专门抽提小RNA的试剂盒得到小RNA，逆转录RNA的上样量应在0.1至1 μg 之间。一般RNA上样量按照建议量1ul，如果结果不好，最多可以上到9ul；
操作合格的情况下，总体积20ul 可以缩量到10ul 进行实验。
将配好体系的PCR反应管或96孔板放入Real Time PCR仪，并按照下表设置PCR反应条件：
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操作步骤
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反应条件
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温度
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时间
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逆转录（1个循环）
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50℃
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15 minutes
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预变性（1个循环）
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95℃
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5 minutes
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40个循环
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变性
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95℃
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15 seconds
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退火
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60℃
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30 seconds
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延伸
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熔解曲线
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变性
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95℃
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15 seconds
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退火
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60℃
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10 seconds
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变性
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95℃
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15 seconds
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Thermofisher 仪器设置示例：注意（非常重要）：
请在Plate 选择界面，passive reference 选择none；一般机器会默认选择ROX，这样会导致输出信号错误；
重新选择none，然后重新分析数据，可以得到正确的实验结果；
数据分析；
1．请看目的基因和内参基因的扩增曲线和熔解曲线，熔解曲线应该为77-84度的一个单峰曲线；导出原始数据CT值；
2．计算样本的delta CT（同一样本的目的microRNA的CT值减去内参的CT值），样本一般设置双重复或者三重复；重复样本的CT值先取均值；再相减；
3．该样本的含量为2 -delta CT；
技术支持
有关技术支持和更多信息，请浏览www.biotnt.com的网页或致电BioTNT的技术支持部门。