产品参数
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链霉亲和素磁珠,也称 Streptavidin 磁珠或 SA 磁珠,是粒径为 200nm 的纳米磁珠表面上共价结合了大量的高质量的链霉亲和素(Streptavidin)。纳米级磁珠提供的超大比表面积,具有更多的结合位点,磁珠使用量更少,非特异性吸附率低,可以快速、高效、灵敏、
特异性地与生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白、多肽、凝集素等分子结合。主要用于分离纯化生物素标记的核酸、抗体、蛋白或相关复合物等,用于免疫沉淀(IP)、细胞分选、DNA-蛋白相互作用研究等。
链接的说明书为正装说明书,试用装的量为100ul。
如何自行构建流式细胞分选磁珠
1.采购相应的 生物素Biotin 标记的抗体;
以大鼠 rat CD90.1 磁珠为例,我们在thermofisher 的官网上找到了这款产品:
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), Biotin, eBioscience™
价格很合算,50ug,671RMB;
搭配我们的磁珠产品就可以构建rat CD90.1 磁珠了;
我们的产品:
链霉亲和素磁珠
操作步骤:
1.计算:结合能力: ≥0.5mg 生物素化 IgG/mL 磁珠 ;所以100ul 磁珠结合50ug 抗体;
2. 配置buffer 2:PBS(pH7.4),0.05% Tween 20,可根据需要添加 0.01∽0.1%BSA
3. 结合生物素化抗体/蛋白;
3.1 将磁珠置于漩涡振荡器上 20s,振荡重悬磁珠。用移液器移取 100μL 磁珠到新的离心管中。将离心管置于磁力架上,静置 1min(此操作后续简称为磁性分离),用移液器吸去上清液,从磁力架上取下离心管。
3.2 加入 1mL Buffer 2 到离心管中,盖上离心管盖,充分振荡重悬磁珠。磁性分离,移去上清液。
3.3 重复“步骤 3.2”两次,共洗涤 3 次。
3.4 加入 1mL 的用 Buffer 2 稀释的生物素化抗体/蛋白(50ug),充分振荡重悬磁珠。将离心管置于旋转混合仪上,室温旋转混合 60min。
3.5 磁性分离,将上清液转移至新的离心管。按“步骤 3.2”的方法洗涤磁珠 5 次。
3.6 根据后续实验的要求,加入合适的缓冲液,重悬磁珠。至此结合生物素化抗体/蛋白步骤完成。磁珠可用于后续操作。
注意:阳性磁珠分选后,如果后续实验对“磁珠仍挂在细胞上”敏感(如流式二次分选、某些体内移植、高分辨率显微成像),就需要把磁珠从细胞表面“解离”下来。Miltenyi 官方提供现成的 REAlease MicroBead 系列(自带可剪切连接臂),但常规抗体磁珠多为“不可逆”结合,因此需用酶法解离。
实验室最常用且不影响活力与表型的解离液成分如下(来源于网上,未验证):
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解离缓冲液(pH 7.2–7.4,无菌过滤)
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0.5 mmol/ L EDTA(或 2 mmol /L EGTA)
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0.1 %(w/v)BSA(或 2 % FBS,保护细胞膜)
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1×PBS(无 Ca²?/Mg²?,防止整合素介导再聚集)
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剪切酶
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0.05–0.1 mg /mL Pronase E(Sigma P6911,广谱丝氨酸+金属蛋白酶,37 ℃ 5–10 min 即可切断小鼠 IgG Fc 段与磁珠表面抗体的结合);
或
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0.5 mg /mL TrypLE Express(Gibco 12604021,温和重组胰酶,37 ℃ 10–15 min)。
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终止/中和
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加入 2 倍体积含 10 % FBS 的完全培养基(FBS 中的 α?-抗胰蛋白酶和 α?-巨球蛋白可立即灭活 Pronase)。
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4 ℃ 300×g 5 min 离心,重悬于新鲜培养基。