设计RNA fish 探针，并进行多探针设计策略。

设计合成，仅收取合成费用。具体费用见合成。

可以选择不同的标记，优先使用多探针原则。

设计原则如下：

1. 目标序列选择

• 特异性：优先选择靶RNA的特异区域（如外显子、非编码RNA的独特序列），避免与其他基因的同源区交叉杂交。
• 保守性：若需检测不同物种的同源RNA，需选择保守区域；若区分亚型/剪接变体，则需针对可变区域。
• 二级结构：通过工具（如RNAfold）预测靶RNA的二级结构，避免设计在高度折叠的区域（可能阻碍探针结合）。

2. 探针长度与覆盖

• 单探针长度：通常20-30 nt，过短可能降低结合力，过长易引入非特异结合。
• 多探针策略：设计多个探针（如20-30个）覆盖靶RNA全长（尤其长非编码RNA），以增强信号并减少单点突变的影响。
• 间隔：探针间保留少量间隔（如5-10 nt），避免空间位阻。

3. 探针特异性验证

• BLAST比对：确保探针序列与无关RNA无显著同源性。
• 交叉杂交检查：排除与相近序列（如同家族基因、假基因）的潜在结合。

4. 探针修饰与标记

• 荧光标记：常用Cy3、Cy5、FITC等荧光基团，需考虑光稳定性和显微镜通道匹配。

5. 杂交条件优化

• Tm值平衡：设计探针组的Tm值应接近（±5°C），确保一致杂交条件。
• 严格性控制：通过甲酰胺浓度、盐离子强度和温度调节，减少非特异结合。

6. 避免常见干扰

• 重复序列：排除靶序列中的高重复区域（如Alu元件），防止非特异信号。
• GC含量：控制在40-60%，避免高GC（难解链）或低GC（结合弱）。

7. 实验验证

• 阳性/阴性对照：包括已知表达样本和不表达样本。
• 信号噪声比：通过无探针或无关探针样本评估背景。