产品参数
GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/MYC/ V5- VHH -Magnetic agarose Beads / (IP/Co-IP) 试剂盒
本说明书适用于以下货号产品：
纳米琼脂糖磁珠货号：ALPA-GTMA/ ALPA-RTMA/ ALPA-FTMA/ ALPA-HTMA/ ALPA-YTMA/ ALPA-BTMA/ ALPA-VTMA, 规格： 1000ul，5000ul
纳米琼脂糖磁珠(IP/Co-IP) 试剂盒货号：ALPA-GTMAK/ ALPA-RTMAK/ ALPA-FTMAK/ ALPA-HTMAK/ ALPA-YTMAK/ ALPA-BTMAK/ ALPA-VTMAK（10T, 50T, 50T*5）
储存条件： 短期使用可 4℃保存， 长期-20℃保存，避免反复冻融。
【产品描述】：
纳米琼脂糖磁珠为偶联 anti- GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/ MYC/ V5纳米抗体的琼脂糖珠子用于免疫沉淀GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/ HA/ MBP/ MYC/ V5 等融合蛋白，仅包含琼脂糖磁珠。
纳米琼脂糖磁珠(IP/Co-IP) 试剂盒包含以下四个组分。
【产品组成】：
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10T
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50T
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50T*5
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纳米琼脂糖珠
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0.1ml
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500ul
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500ul*5
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IP配套洗液（5*）BLK-2
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100ml
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100ml
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100ml*5
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细胞裂解液 BLK-1
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30ml
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30ml
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30ml*5
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还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2X
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5ml
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5ml
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5ml*5
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【应用范围】：
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性测定、质谱分析等；
【特异性】：
GFP 款可以结合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP 等； RFP 可结合 mCherry。
【产品特性】：
存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。配基 ：羊驼纳米抗体（抗体分子量仅14 kDa)
每反应推荐用量 10μL；
【需要但试剂盒中没有提供的试剂和仪器准备】：
前三种液体为 IP（COIP）试剂盒的组成部分，如果没有购买IP(COIP)试剂盒，可以按照成分来进行配制；后面几种产品也提供了相应配方和推荐货号。
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缓冲液名称
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推荐使用Biotnt产品
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规格
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IP 配套洗液（5*）
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IP 试剂盒（BLK-2）
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100ml
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还原型SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2X
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IP 试剂盒（A20120A0210-2）
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5ml
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细胞裂解液
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IP 试剂盒（BLK-1）
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30ml
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IP 非还原洗脱液
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BLK-3
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10ml
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IP 中和液
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A20120A0203-2
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10ml
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磷酸化蛋白和蛋白酶抑制剂cocktail
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A20120A0105-1
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500ul
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PMSF（200X）
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A20120A0105-2
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1ml
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磁力架
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L-5001/L-5002/L-5003等
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4/8/16孔磁力架
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PBS
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无菌PBS
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500ml
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注意：使用前在裂解液、洗液或IP& co-IP裂解、结合、清洗buffer中添加适量的蛋白酶抑制剂。
【实验步骤】：
步骤一： 样本处理
1.1 植物组织裂解处理：
取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵中进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液（已添加蛋白酶抑制剂 PMSF 等）进行裂解，为了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震荡 30min，裂解完成后 12000 rpm，离心 30min，吸取上清置于新的离心管中，弃去沉淀。
1.2 动物样本：
1.2.1 收集细胞：
每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 cm 培养皿）表达标签蛋白融合蛋白。吸出生长培养基、向培养皿中加入 2ml 预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g 离心 3 分钟并丢弃上清液。
1.2.2 细胞裂解：
1．用 250μl 预冷的细胞裂解液（BLK-1）重悬细胞，在裂解液（BLK-1）中按照体积比加入蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂可以自备，或者用BioTNT 货号 A20120A0105进行配制）。对于核/染色质蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入 1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2，蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF（自备）。
2．把离心管放置在冰上 30 分钟，可以每 10 分钟充分吹打一次。
3．细胞裂解产物在 4℃，20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。
步骤二. IP（COIP）实验
平衡珠子：
4. 振荡混匀GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads，吸取 10μl 琼脂糖磁珠混悬液 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液（BLK-1）中，4℃，2,500g离心 2 分钟，丢弃上清液。（此步骤可选）
结合蛋白
5.将细胞裂解产物加入到平衡的 GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads 中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20μl 琼脂糖磁珠混悬液），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 15-30 min。如果需要，保存 50 μl 的裂解产物进行免疫印迹分析。
6. 4℃，2,500g 离心 2 分钟，丢弃上清液。如果需要，留存 50μl 上清液进行免疫印迹分析。
清洗珠子：
7. 用 500μl 预冷的裂解缓冲液（BLK-1）中重悬 6 中的 GFP/Myc/RFP/HA/ DYKDDDDK/ MBP/ V5-Nanoab-Agarose，4℃，2,500g 条件下离心 2 分钟，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。
洗脱蛋白：
方案一：变性洗脱法（此方法洗脱的样品适用于PAGE、WB检测）
8． 加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重悬 GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/ MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads。在 95℃，10 min 条件下，加热 GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/ MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来。2,500g 离心 2分钟收集上清，收集的产物可进行 SDS-PAGE 及免疫印迹分析。
方案二：非变性洗脱法（此方法保持原有的生物活性，可用于功能分析、质谱分析，也适于抗体纯化）
9． 替代步骤 8的可选步骤：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，2,500g 离心 2 分钟收集上清，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）（beads 已验证可以不添加 Tris 进行中和，只需用 PBS 清洗 3-5 次即可回收 beads）。
注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。
方案三：
如需进行 GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/ MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads 融合酶的活性检测，无需洗脱，可以直接检测。
方案四：
如需进行染色质免疫沉淀（ChIP） 实验，主要用于含有 GFP 融合蛋白的蛋白质/DNA 相互作用的实验。染色质免疫沉淀一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化以及 DNA 的鉴定。其中前期细胞固定，染色质断裂不变；然后接着直接进入说明书的第5 步，加入细胞裂解产物后，DNA-蛋白质复合物结合到GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/HA/ MBP/MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads 上；进入第 6 和 7 步，分离得到复合物；进入第 10 步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA 的纯化及 DNA 的鉴定等同于普通的 ChIP 实验。RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验步骤同上。
方案五：
GFP/ RFP/ DYKDDDDK（FLAG）/ HA/ MBP/ MYC/ V5-Nanoab- agarose Beads 不仅可以用于在体内外检测和验证蛋白质之间的相互作用，也可以结合质谱分析筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步骤同免疫沉淀法，得到洗脱的复合物后，然后进行 SDS–PAGE 分析，用考马斯亮蓝或者银染的方法染色后，切下未知蛋白的条带，用质谱技术鉴定未知蛋白。