无内毒素质粒小提中量制备试剂盒

（增强离心柱型）

BK2104：25次 / 100 次

试剂盒组成

注意事项：

*平衡液CBS：用于活化吸附柱硅胶膜，提升质粒结合效率。

*漂洗液WS：使用前按 1:4体积比加入无水乙醇(或95%乙醇)。

工业大包装规格，请单独询价。

产品特点简介：

l 本试剂盒采用优化的溶液配方，和独特的核酸吸附膜，可以使用台式高速离心机，通过简单的操作，获取低内毒素或者超低内毒素含量的高浓度的质粒，非常适合于小量提取几十到上百微克低内毒素质粒，用于转染等实验。

l 高效吸附：硅胶膜吸附柱容量可达 100 μg，洗脱体积可以低至 50µL，易获得高浓度低内毒素含量的质粒。

l  高纯度、高浓度、低内毒素：

快速内毒素清除方案，所提质粒内毒素水平在 1EU/ug 级别。深度内毒素清除方案，所提质粒内毒素水平 <0.05 EU/μg（以中高拷贝质粒为例），显著优于常规方法（>1000 EU/μg）。

l  快速流程：结合碱裂解与膜吸附技术，操作全程约 1 小时。

保存与运输：

l  RNase A：2~8℃保存，常温运输（长期存放需-20℃）。初次使用本试剂盒时，请将 RNase A 全部加入溶液 SI 中，均匀混合后，4℃保存。超过 3 个月，需要适当补加 RNase A。

l  其它组分：室温（15-25℃）稳定保存 18 个月；高温环境或长期保存，建议 2-8℃保存。

l  运输条件：常温运输，高温季节建议添加冰袋。

实验前准备：

l  首次使用前，请仔细完整阅读说明书。

l  确认溶液 SI 中已经加入 RNase A，并做好标记。

l  检查漂洗液 WS 是否按比例添加入乙醇。

l  室温较低时，若溶液 SII 出现沉淀，37℃加热溶解后冷却至室温使用。

l  使用新鲜过夜培养的菌液（推荐 2YT 培养基）。

快速操作指南(Quick Guide)

注：以下操作使用 1.5mL/2mL 离心管及台式高速离心机。

Ø DNA 吸附柱平衡处理

1.    向 GP3 柱加 200 µL 平衡液 CBS，静置 2 分钟，12000×g 离心 1 分钟，弃废液，待用。

Ø 菌体收集、裂解与澄清

2.    菌体收集： 根据菌液生长状态，通过多次离心收集所需要的菌体量。离心条件：8000rpm 离心 1 分钟，弃上清。

LB 培养基收集 4-8 mL；2YT 培养基收集 2~4 mL。

3.    重悬菌体：每管加入 500 µL 溶液 SI，振荡至无可见菌块。

4.    裂解处理：每管加入 500 µL 溶液 SII，轻柔翻转混匀 4~10

次，形成透明裂解液（裂解时间≤5 分钟）。

5.    中和并澄清沉淀：每管加入 400 µL 溶液 SIV，翻转混匀 8~10

次，室温静置 10 分钟，12000xg 离心 5 分钟。

Ø 内毒素清除

6A：快速内毒素清除方案：直接吸取 1.1mL 上清到一新的 2mL离心管，准确加入 440µL 溶液ePB，混匀，转到步骤 7。

6B：深度内毒素清除方案：

转移步骤 5 所得上清到一新的 1.5mL 离心管中，加入 80µL溶液 GETR，颠倒混匀，然后转移到 42℃水浴中放置 1~2 分钟，溶液将变浑浊。

室温 12000xg 离心 3 分钟，溶液将分层。离心后，静置约

2~5 分钟，直到蓝色有机相都沉于管底。

小心吸取 1.1mL 上清到新的 2mL 离心管，准确加入 440µL 溶液 ePB，混匀，转到步骤。

Ø 质粒纯化

7 . 离心过柱：分两次将上一步所得的混合液转移到 GP3 柱中，每次不要超过 800µL，每次 12000×g 离心 1 分钟。

8.    漂洗：依次加入 500 μL 溶液 eW1、500 μL 漂洗液 WS（两次），每次 12000×g 离心 1 分钟。

9.    干燥：12000xg 离心 3 分钟，并室温放 5 分钟彻底去除乙醇。

Ø 质粒洗脱

10.  根据预估质粒量，加入 50~100 μL 洗脱缓冲液eEB，室温静置 5 分钟，12000×g 离心 2 分钟收集洗脱液。最小洗脱体积不要低于 50µL。

Ø 质量检测

电泳检测：测量浓度，并取 1-3 μL 样品进行琼脂糖凝胶电泳（建议稀释后检测，DNA 总量不超过 500ng）

保存建议：-20℃长期保存，避免反复冻融。质粒提取注意事项：

1.   吸附柱 GP3 处理注意事项：

•  GP3 柱预处理：使用前需经柱平衡液处理，可显著提升质粒吸附效率和柱体可靠性。

•  操作时机：建议与上清液做内毒素清除步骤同步进行。

2.   菌液培养条件及用量相关：培养基选择：

•  小量质粒提取：可以使用 LB 培养基或 2YT 培养基。

•  中/大量质粒提取：优先选用 2YT 培养基。

培养条件：

•  采用小体积培养基+高转速培养确保溶氧量。

•  建议预实验：取 2mL 菌液小提验证质粒质量及产量。

质粒提取时菌液用量建议：

• LB 培养基 4-8 mL；2YT 培养基 2-4 mL。如果想使用更多的菌液，则需要将菌液分 2 管进行处理，所得上清液多次离心到一根 GP3 柱中，以便获得更多量的质粒。

•  勿使用过量的菌液。菌液过多，裂解不充分，会导致质粒产量降低，质量下降。

菌液短期保存：-20℃速冻后转 4℃保存（有效期 2 天）。

3.   菌体裂解注意事项：

•  加入溶液SII 后，可翻转摇匀至澄清透明状，否则菌液过量。

•  加入溶液 SIV 后，要充分混匀，必要时，较用力摇匀。否则后面离心澄清上清时，沉淀不结实，或者成粘团状，上清不易从沉淀中分离出来。

4.   深度内毒素清除环节注意事项：处理流程：

•  上清液加入内毒素清除剂 GETR 后，一般无需冷却，直接进行加热处理分相即可。如果想去除内毒素更彻底些，在加入溶液 GETR 后，可以做一步冰水浴处理。

•  离心分相后，需要静置 5~10 分钟，使大部分有机相液滴沉于离心管底部，便于后面操作。

上清水相转移方式：

• 5~10mL 以下的较小体积，建议直接用移液器吸取。

• 10mL 以上的较大体积，直接倾倒（注意不要倒出下层液体）。

质粒提取常见问题分析：

1.     质粒产量偏低，浓度过低：原因分析：

•  菌体量不足：培养时间短、接种量不足或菌种质量欠佳。

•  质粒拷贝数低：质粒本身拷贝数低或宿主菌不适合。

•  裂解不充分：裂解时间短或裂解液浓度不足。

•  质粒丢失：操作过程中发生错误或溶液使用错误。

•  洗脱不充分：洗脱液体积不足或洗脱时间短。

解决办法：

•  增加菌体量：延长培养时间或增加接种量。

•  选择高拷贝质粒或适合的宿主菌。

•  优化裂解条件：延长裂解时间或调整裂解液用量。

•  避免剧烈操作，防止质粒降解。

•  增加洗脱液体积或延长洗脱时间。

2.     菌体裂解后过于粘稠，不易离心：原因分析：

•  菌体使用过量：使用了过多的菌液，或菌液放置时间过长。

•  裂解操作不到位：加入溶液SIV 后未充分混匀。

解决办法：

•  减少菌体量：使用合适的菌液量提取质粒。

•  按照前面质粒提取注意事项第 3 条，合理操作。

3.     质粒提取后电泳条带异常，出现多条带，出现 RNA 干扰带原因分析：

•  质粒构型多样：超螺旋、线性、开环质粒共存。

•  质粒二聚体或多聚体：质粒在提取过程中形成多聚体。

•  宿主基因组 DNA 污染：裂解过度或操作幅度过大。

•  有 RNA 残留：溶液 SI 放置过久，RNA 酶活性降低。

解决办法：

•  分析质粒构型：必要时将质粒酶切后再电泳检测。

•  优化菌体生长条件及提取条件，减少质粒多聚体形成。

•  控制裂解条件：使用合适的菌液量，轻柔操作，避免基因组 DNA 对质粒提取的影响。

•  合理使用 RNA 酶：溶液 SI 加入 RNA 酶后，如果放置时间较长，需补加 RNA 酶；或者在质粒提取时，在加入溶液 SIV步骤后面，直接补加 10µL RNA 酶，以增加 RNA 酶活性。