无内毒素质粒中量制备试剂盒

（离心柱型离心法）

BK2008：10次 / 50 次

试剂盒组成

注意事项：

*平衡液CBS：用于活化吸附柱硅胶膜，提升质粒结合效率。

*漂洗液WS：使用前加入4倍WS体积无水乙醇(或95%乙醇)。

产品特点简介：

l 本试剂盒提供了一个在台式高速离心机上，使用 2mL 小离心管，提取 100~200ug 质粒的方案。

l 本试剂盒是 BK2009 的小离心柱版本，原理相同。mg 级质粒提取，可选择 BK2009（无内毒素质粒大量制备试剂盒）。

l 高效吸附：硅胶膜吸附柱容量 100-200μg，视质粒拷贝数及大小有较大差别。

l 高纯度低内毒素：提取质粒内毒素水平 <1 EU/μg（以中高拷贝质粒为例），显著优于常规方法（>1000 EU/μg）。

l 如果需要处理更多的菌液，及内毒素含量更低的质粒，请选择 BK2108（增强型无内毒素质粒中量制备试剂盒）。

l  快速流程：结合碱裂解与膜吸附技术，操作全程小于 1 小时。

l 灵活兼容：可以灵活使用不同的菌液量提取质粒，合并吸附到一根 GP4 柱中，最多可提取 200 ug 质粒。

保存与运输：

l  RNase A：2~8℃保存，可常温运输（半年以上长期存放建议放-20℃）。初次使用本试剂盒时，请将 RNase A 全部加入 Solution I 中，均匀混合后，4℃保存。

l  其它组分：室温（15-25℃）稳定保存 18 个月；高温环境或长期保存，建议 2-8℃保存。

l  运输条件：常温运输，高温季节建议添加冰袋。

实验前准备：

l  首次使用前，请仔细完整阅读说明书。

l  检查漂洗液WS 是否已添加4 倍体积无水乙醇（或95%乙醇）。

l  室温较低时，若溶液 SII 出现沉淀，37℃加热溶解后冷却至室温使用。

l  使用新鲜过夜培养的菌液（推荐 2YT 培养基）。

快速操作指南(Quick Guide)

Ø DNA 吸附柱平衡处理

1.    向 GP4 柱加 400 µL 平衡液CBS，静置 2 分钟，6000×g 离心

2 分钟，弃废液，待用。

Ø 菌体收集、裂解与澄清

2.    菌体收集： 每份样品收集 2 管菌液，通过多次离心收集所需要的菌体量。

每管收集菌液体积建议（LB 培养基 6-8 mL；2YT 培养基 4~6

mL），8000rpm 离心 1 分钟，弃上清。

3.    重悬菌体：每管加入 500 µL 溶液 SI，振荡至无可见菌块。

4.    裂解处理：每管加入 500 µL 溶液 SII，轻柔翻转混匀 4~10

次，形成透明裂解液（裂解时间≤5 分钟）。

5.    中和并澄清沉淀：每管加入 400 µL 溶液 SIV，翻转混匀 8~10

次，室温静置 10 分钟，12000rpm 离心 5 分钟。

6.    上清液调节：合并步骤 5 中的两管上清液到一支新的 5mL 收集管中（试剂盒中提供），估计可得到 2.5~2.7mL 的上清，然后加入 1.1mL 溶液 ePB 并颠倒混匀备用。

注：如果上清液体积与 2.5~2.7mL 相差较多，按照实际上清液体积 40%加溶液 ePB。

Ø 质粒纯化

7.  吸附柱吸附质粒：步骤 6 所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到 GP4 柱中。混合液用量≤800 µL/次，12000rpm 离心 1 分钟。

8.  漂洗：依次加入 500 µL 溶液 eW1、500 µL 漂洗液 WS（两次），每次 12000rpm 离心 1 分钟。

9.  干燥：12000rpm 离心 3 分钟，将 GP4 柱放入新的 1.5mL 离心管中，打开管盖，并室温放置 5 分钟彻底去除乙醇。

Ø 质粒洗脱

10.  加入 100 µL 洗脱缓冲液 EB，盖好 GP4 柱管盖，室温静置 5

分钟，12000rpm 离心 2 分钟收集洗脱液。

11.  二次洗脱：如果预期质粒总量超过 100ug，可以按照步骤 10，用 80 µL 洗脱缓冲液EB 做第二次洗脱，测定其质粒浓度，决定是否与第一次洗脱液合并使用。

Ø 质量检测

电泳检测：测量浓度，并取 1-3 μL 样品进行琼脂糖凝胶电泳（建议稀释后检测，DNA 总量不超过 500ng）

保存建议：-20℃长期保存，避免反复冻融。

质粒提取注意事项：

1.   吸附柱 GP4 处理注意事项

•  GP4 柱预处理：使用前需经柱平衡液处理，可显著提升质粒吸附效率和柱体可靠性。

•  操作时机：建议在菌液裂解时同步处理 GP4 柱。

2.   关于 BK2008 和 BK2108 选择

•  预期质粒得率：BK2108 要多于 BK2008 1~2 倍。

•  处理菌液量：BK2108 建议使用 2~3 倍于 BK2008 菌量，通常 BK2108 使用 50mL 离心管处理 15~30mL 菌液。

•  内毒素处理方式：BK2108 做深度内毒素处理，额外耗时约

20~30 分钟。

•  上清液过柱方式：BK2008 以离心法为主，BK2108 以负压抽滤法为主。

3.   菌液培养条件、菌液用量相关培养基选择：

•  小量质粒提取：可以使用 LB 培养基或 2YT 培养基。

•  中/大量质粒提取：优先选用 2YT 培养基。

培养条件：

•  采用小体积培养基+高转速培养确保溶氧量。

•  控制摇菌时长：摇菌时间过长，菌体中质粒会有大量丢失。

•  建议预实验：取 2mL 菌液小提验证质粒质量及产量。

质粒提取时菌液用量建议：

• LB 培养基 6~10 mL；2YT 培养基 4~6 mL。

•  使用过多的菌液，会导致质粒产量降低，质量下降。

菌液短期保存：-20℃速冻后转 4℃保存（有效期 2 天）。

4.   菌体裂解注意事项：

•  加入溶液SII 后，可翻转摇匀至澄清透明状，否则菌液过量。

•  加入溶液 SIV 后，要充分混匀，必要时，较用力摇匀。否则后面离心澄清上清时，沉淀不结实，或者成粘团状，上清不易从沉淀中分离出来。

5.   关于裂解指示剂的使用

•  加入裂解指示剂，可以观察菌液裂解及中和时，溶液是否混合充分。如果未能充分混合，则裂解液颜色不均匀。

•  添加裂解指示剂，不会对提取的质粒质量产生影响。

•  如果需要裂解指示剂，可以单独购买。

质粒提取常见问题分析：

1.     质粒产量偏低，浓度过低原因分析：

•  菌体量不足：培养时间短、接种量不足或菌种质量欠佳。

•  质粒拷贝数低：质粒本身拷贝数低或宿主菌不适合。

•  裂解不充分：裂解时间短或裂解液用量不足。

•  质粒丢失：操作过程中发生错误或溶液使用错误。

•  洗脱不充分：洗脱液体积不足或加洗脱后放置时间短。

解决办法：

•  增加菌体量：延长培养时间或增加接种量。

•  选择高拷贝质粒或适合的宿主菌，使用新转化的菌种。

•  优化裂解条件：延长裂解时间或调整裂解液用量。

•  避免剧烈操作，防止质粒降解。

•  增加洗脱液体积或加入洗脱液后延长放置时间到 10 分钟。

2.     菌体裂解后过于粘稠，不易离心原因分析：

•  菌体使用过量：使用了过多的菌液，或菌液放置时间过长。

•  裂解操作不到位：加入溶液SIV 后未充分混匀。

解决办法：

•  减少菌体量：使用合适的菌液量提取质粒。

•  按照前面质粒提取注意事项第 3 第 4 条，合理操作。

3.     质粒提取后电泳条带异常，出现多条带，出现 RNA 干扰带原因分析：

•  质粒构型多样：超螺旋、线性、开环质粒共存。

•  质粒二聚体或多聚体：质粒在提取过程中形成多聚体。

•  宿主基因组 DNA 污染：裂解过度或操作幅度过大。

•  有 RNA 残留：溶液 SI 放置过久，RNA 酶活性降低。

解决办法：

•  分析质粒构型：必要时将质粒酶切后再电泳检测。

•  优化菌体生长条件及提取条件，减少质粒多聚体形成。

•  控制裂解条件：使用合适的菌液量，轻柔操作，避免基因组 DNA 对质粒提取的影响。

•  合理使用 RNA 酶：大提质粒时，一般不将 RNase A 加入到溶液 SI 中，而是在加入溶液 SIV 步骤后面，直接加 RNase A，可以显著提高 RNA 酶活性，减少 RNA 对质粒提取的影响。小提质粒时，为实验方便，可以直接将 RNase A 加入到溶液 SI 中，并放 4℃保存。如果加入 RNase A 后放置时间较长，需再额外补加 RNase A。