增强型无内毒素质粒中量制备试剂盒

（离心柱型负压抽滤/离心法）

BK2108：10次 / 40 次

试剂盒组成

注意事项：

*平衡液CBS：用于活化吸附柱硅胶膜，提升质粒结合效率。

*漂洗液WS：使用前按 1:4体积比加入无水乙醇(或95%乙醇)。

工业大包装规格，请单独询价。

产品特点简介：

l 本试剂盒使用 50ml 离心管，可处理足量菌液。同时使用 2ml离心管和小型吸附柱 GP4，采用优化的溶液配方，和独特的负压抽滤设计，可以快速高效地纯化质粒，提高处理通量。

l 高效吸附：硅胶膜吸附柱容量 100-300 μg，视质粒拷贝数及大小有较大差别。

l 高纯度低内毒素：提取质粒内毒素水平 <0.05 EU/μg（以中高拷贝质粒为例），显著优于常规方法（>1000 EU/μg）。

l  快速流程：结合碱裂解与膜吸附技术，操作全程约 1.5 小时。

l 灵活兼容：50 mL/15 mL 离心管处理菌液及上清，小吸附柱纯化质粒，灵活高效。

保存与运输：

l  RNase A：2~8℃保存，常温运输（长期存放需-20℃）。初次使用本试剂盒时，请将 RNase A 全部加入溶液 SI 中，均匀混合后，4℃保存。

l  其它组分：室温（15-25℃）稳定保存 18 个月；高温环境或长期保存，建议 2-8℃保存。

l  运输条件：常温运输，高温季节建议添加冰袋。

实验前准备：

l  首次使用前，请仔细完整阅读说明书。

l  确认溶液 SI 中已经加入 RNase A，并做好标记。

l  检查漂洗液 WS 是否按比例添加入乙醇。

l 室温较低时，若溶液 SII 出现沉淀，37℃加热溶解后冷却至室温使用。

l  使用新鲜过夜培养的菌液（推荐 2YT 培养基）。

快速操作指南(Quick Guide)

注：以下步骤（1~8），使用 50ml 或 15ml 离心管及角转子离心。使用水平转子离心，参数见括号内标注的参数。

Ø 菌体收集、裂解与澄清

1.    菌体收集：

取合适量菌液（LB 培养基 20-40 mL；2YT 培养基 15-20 mL）， 6000×g 离心 3 分钟（水平转子：4000rpm，10 分钟），弃上清。

2.    重悬菌体：加入 3 mL 溶液 SI，振荡至无可见菌块。

3.    裂解处理：加入 3 mL 溶液 SII，轻柔翻转混匀 4-6 次，形成透明裂解液（≤5 分钟）。

4.    中和并澄清沉淀：加入 2.4 mL 溶液 SIV，翻转混匀 8-10 次，

室温静置10 分钟，10000×g 离心5 分钟（水平转子：4000rpm，

5 分钟）。

Ø 内毒素清除

5.    转移上清至 15 mL 尖底离心管（约 7-7.5 mL），加入 1.0 mL

溶液 GETR，混匀。此步操作可以用 50ml 离心管替代。

6.    可选步骤：冰水浴 3-5 分钟（能适当提高内毒素清除率）。

7.    42℃水浴 3-5 分钟至溶液浑浊，离心分层（室温 10000×g，

5 分钟）(水平转子：4000rpm，5 分钟)。然后静置 5~10 分钟，使分层清晰。

8.    准确吸取 5.0 mL 上清，加入 2.0 mL 溶液 eDBS（按上清液

体积 0.4 倍比例添加），混匀备用。

注：以下步骤使用 1.5ml/2ml 离心管及台式高速离心机。

Ø 质粒纯化

9.    吸附柱平衡：（在处理上清期间处理）向 GP4 柱中加 400 μL平衡液 CBS，静置 2 分钟，12000×g 离心 1 分钟，弃废液。

10.  负压吸附： 将延长管插入GP4 柱，将混合液转移至延长管，通过负压抽滤至液体通过GP4 柱（若残留液体可离心处理）。

11.  漂洗：依次加入 600 μL 溶液 eDBS、600 μL 漂洗液 WS（两次），每次 12000×g 离心 1 分钟。

12.  干燥：12000xg 离心 3 分钟，并室温放 5 分钟彻底去除乙醇。

Ø 质粒洗脱

13.  加入 80 μL 洗脱缓冲液eEB，室温静置 5 分钟，12000×g 离

心 2 分钟收集洗脱液。

14.  重复洗脱：再次加入 80 μL eEB，按步骤 13 做第二次洗脱，合并洗脱液（总产量可提升 20-30%）。如果预期质粒产量不高，则两次洗脱独立收集，检测后再决定是否合并。

Ø 质量检测

电泳检测：测量浓度，并取 1-3 μL 样品进行琼脂糖凝胶电泳（建议稀释后检测，DNA 总量不超过 500ng）

保存建议：-20℃长期保存，避免反复冻融。

质粒提取注意事项：

1.   吸附柱 GP4 处理注意事项：

•  GP4 柱预处理：使用前需经柱平衡液处理，可显著提升质粒吸附效率和柱体可靠性。

•  操作时机：建议与上清液做内毒素清除步骤同步进行。

2.   菌液培养条件及用量相关：培养基选择：

•  小量质粒提取：可以使用 LB 培养基或 2YT 培养基。

•  中/大量质粒提取：优先选用 2YT 培养基。

培养条件：

•  采用小体积培养基+高转速培养确保溶氧量。

•  建议预实验：取 2ml 菌液小提验证质粒质量及产量。

质粒提取时菌液用量建议：

• LB 培养基 20-40 mL；2YT 培养基 15-20 mL。

•  勿使用过量的菌液。菌液过多，裂解不充分，会导致质粒产量降低，质量下降。

菌液短期保存：-20℃速冻后转 4℃保存（有效期 2 天）。

3.   菌体裂解注意事项：

•  加入溶液SII 后，可翻转摇匀至澄清透明状，否则菌液过量。

•  加入溶液 SIV 后，要充分混匀，必要时，较用力摇匀。否则后面离心澄清上清时，沉淀不结实，或者成粘团状，上清不易从沉淀中分离出来。

4.   关于离心相关注意事项：

•  角转子：离心效果好，但是通量较低。

•  水平转子：通量大，但需延长离心时间补偿离心力不足。

5.   内毒素清除环节注意事项：处理流程：

•  上清液加入内毒素清除剂 GETR 后，一般无需冷却，直接进行加热处理分相即可。如果想去除内毒素更彻底些，在加入溶液 GETR 后，可以做一步冰水浴处理。

•  离心分相后，需要静置 5~10 分钟，使大部分有机相液滴沉于离心管底部，便于后面操作。

上清水相转移方式：

• 5~10ml 以下的较小体积，建议直接用移液器吸取。

• 10ml 以上的较大体积，直接倾倒（注意不要倒出下层相）。

6.   延长管使用要点：

•  连接方式：延长管插入 GP4 柱管口，然后再将 GP4 柱插到负压装置上。

•  操作限制：单次处理上清液量≤7ml（防堵柱），个别样品还可能堵柱子，此时将剩余液体离心过柱即可。

•  残留处理：未过滤完的液体改用离心法完成吸附。

7.   关于质粒洗脱：

•  预期总质粒量低于 100ug，直接用 80µl eEB 洗脱一次；或者 80µl eEB 洗脱第二次，单独收集，视第二次洗脱浓度决定是否合并到第一次洗脱液中。

•  预期超过 150ug，用 80µl eEB 洗脱两次，并收集到同一离心管中。

质粒提取常见问题分析：

1.     质粒产量偏低，浓度过低：原因分析：

•  菌体量不足：培养时间短、接种量不足或菌种质量欠佳。

•  质粒拷贝数低：质粒本身拷贝数低或宿主菌不适合。

•  裂解不充分：裂解时间短或裂解液浓度不足。

•  质粒丢失：操作过程中发生错误或溶液使用错误。

•  洗脱不充分：洗脱液体积不足或洗脱时间短。

解决办法：

•  增加菌体量：延长培养时间或增加接种量。

•  选择高拷贝质粒或适合的宿主菌。

•  优化裂解条件：延长裂解时间或调整裂解液用量。

•  避免剧烈操作，防止质粒降解。

•  增加洗脱液体积或延长洗脱时间。

2.     菌体裂解后过于粘稠，不易离心：原因分析：

•  菌体使用过量：使用了过多的菌液，或菌液放置时间过长。

•  裂解操作不到位：加入溶液SIV 后未充分混匀。

解决办法：

•  减少菌体量：使用合适的菌液量提取质粒。

•  按照前面质粒提取注意事项第 3 条，合理操作。

3.     质粒提取后电泳条带异常，出现多条带，出现 RNA 干扰带原因分析：

•  质粒构型多样：超螺旋、线性、开环质粒共存。

•  质粒二聚体或多聚体：质粒在提取过程中形成多聚体。

•  宿主基因组 DNA 污染：裂解过度或操作幅度过大。

•  有 RNA 残留：溶液 SI 放置过久，RNA 酶活性降低。

解决办法：

•  分析质粒构型：必要时将质粒酶切后再电泳检测。

•  优化菌体生长条件及提取条件，减少质粒多聚体形成。

•  控制裂解条件：使用合适的菌液量，轻柔操作，避免基因组 DNA 对质粒提取的影响。

•  合理使用 RNA 酶：溶液 SI 加入 RNA 酶后，如果放置时间较长，需补加 RNA 酶；或者在质粒提取时，在加入溶液 SIV步骤后面，直接补加 10µl RNA 酶，以增加 RNA 酶活性。