产品参数
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无内毒素质粒大量制备试剂盒
（离心柱型离心法）
BK2009：2次 / 10 次
试剂盒组成
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Components
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BK2009-2
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BK2009-10
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吸附柱 GP6+收集管(GenClean Column GP6)
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2 个
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10 个
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50mL 收集管(50-mL Collection Tube)
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2 个
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10 个
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推杆过滤器 (Push Filter)
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2 个
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10 个
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平衡液 CBS (Buffer CBS)*
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10 mL
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50 mL
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溶液 SI (Solution I)
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25 mL
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120 mL
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溶液 SII (Solution II)
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25 mL
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120 mL
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溶液 SIV (Solution IV)
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20 mL
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100 mL
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溶液 ePB（Solution ePB）
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25 mL
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120 mL
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溶液 eW1 (Solution eW1)
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20 mL
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100 mL
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漂洗液 WS（浓缩）
(Wash Solution)*
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12 mL
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2×24 mL
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洗脱缓冲液 EB
(Elution Buffer)
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10 mL
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30 mL
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Visual Blue
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200 µL
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600 µL
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RNase A (10mg/mL)
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250 µL
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1200 µL
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注意事项：
*平衡液CBS：用于活化吸附柱硅胶膜，提升质粒结合效率。
*漂洗液WS：使用前加入4倍WS体积无水乙醇(或95%乙醇)。
工业大包装规格，请单独询价。产品特点简介：
l 高效吸附：硅胶膜吸附柱容量 1000-4000μg，视质粒拷贝数及大小有较大差别。
l 高纯度低内毒素：提取质粒内毒素水平 <1 EU/μg（以中高拷贝质粒为例），显著优于常规方法（>1000 EU/μg）。
l 快速流程：结合碱裂解与膜吸附技术，操作全程约 2~3 小时。
l 灵活兼容：可以兼具角转子的高速离心和水平转子的高通量。
保存与运输：
l RNase A：2~8℃保存，可常温运输（半年以上长期存放需
-20℃）。
大提质粒时，通常将 RNase A 的添加步骤调整至溶液 SIV加入之后即时添加，可显著提升 RNA 的降解效率，减少后续 RNA 残留对质粒提取的影响。
l 其它组分：室温（15-25℃）稳定保存 18 个月；高温环境或长期保存，建议 2-8℃保存。
l 运输条件：常温运输，高温季节建议添加冰袋。
u 实验前准备：
l 首次使用前，请仔细完整阅读说明书。
l 检查漂洗液 WS 是否按 1:4 比例添加入乙醇。
l 室温较低时，若溶液 SII 出现沉淀，37℃加热溶解后冷却至室温使用。
l 使用新鲜过夜培养的菌液（推荐 2YT 培养基）。
快速操作指南(Quick Guide)
注：以下操作以角转子离心为基准。使用水平转子离心，参数见括号内标注。
Ø 菌体收集、裂解与澄清
1. 菌体收集： 通过多次离心收集所需要的菌体量。
取 50-200 mL 菌液（LB 培养基 100-200 mL；2YT 培养基 50-
100 mL），6000×g 离心 3 分钟（水平转子：4000rpm，10分钟），弃上清。
2. 重悬菌体：加入 10 mL 溶液 SI，振荡至无可见菌块。
（选做）可在此步加入 50μL Visual Blue，用于指示菌液裂解。
3. 裂解处理：加入 10 mL 溶液 SII，轻柔翻转混匀 4~10 次，形成透明裂解液（裂解时间≤5 分钟）。
4. 中和并澄清沉淀：加入 8 mL 溶液 SIV，100 µL RNase A，翻转混匀 8-10 次，室温静置 10 分钟，10000×g 离心 5 分钟
（水平转子：4000rpm，5 分钟）。
5. 使用推杆过滤器将上清液过滤至 50 mL 尖底离心管（可得约
25-27 mL 上清），根据实际体积，准确加入上清液体积 40%
比例的溶液 ePB，（如 25mL 上清液加 10mL ePB）混匀备用。
Ø 质粒纯化
6. 吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向 GP6 柱加 4 mL 平衡液 CBS，静置 2 分钟，6000×g 离心 2 分钟，弃废液。
7. 吸附柱吸附质粒：步骤 5 所得混合液，通过多次离心，将样品吸附到 GP6 柱中。混合液用量≤9 mL/次，6000×g 离心 2 分钟。（水平转子：≤15ml/次，4000rpm，离心 1 分钟）。
8. 漂洗：依次加入 8 mL 溶液 eW1、8 mL 漂洗液 WS（两次），每次 6000×g 离心 2 分钟（水平转子：4000rpm，1 分钟）。
9. 干燥：10000×g 空离 5 分钟，并室温放 5 分钟彻底去除乙醇。
（水平转子：4000rpm，5 分钟，50℃放置 10 分钟）
Ø 质粒洗脱
10. 加入 1.2 mL 洗脱缓冲液 EB，室温静置 5 分钟，10000×g 离
心 3 分钟收集洗脱液。
（使用水平转子：加1.5 mL EB，室温放置5~10 分钟，4000rpm， 5 分钟。并将洗脱液加到膜上，重复洗脱一次以提高洗脱效 率）
11. 二次洗脱：根据实验需要，可按步骤 13 做第二次洗脱，并独立收集洗脱液，备用。一般二次洗脱可回收的质粒量参考：角转子高速离心回收：20%~30%。
水平转子低速离心回收：20%~50%。
Ø 质量检测
电泳检测：测量浓度，并取 1-3 μL 样品进行琼脂糖凝胶电泳（建议稀释后检测，DNA 总量不超过 500ng）
保存建议：-20℃长期保存，避免反复冻融。
质粒提取注意事项：
1. 吸附柱 GP6 处理注意事项：
• GP6 柱预处理：使用前需经柱平衡液处理，可显著提升质粒吸附效率和柱体可靠性。
• 操作时机：建议与上清液做内毒素清除步骤同步进行。
2. 关于离心相关注意事项
• 角转子：离心效果好，尤其是洗脱环节，但是通量较低。
• 水平转子：通量大，但需延长离心时间补偿离心力不足。
• 如果处理的样品数量较大，建议角转子离心机与水平转子离心机搭配使用，以发挥各自优势。
• 如果条件允许，一般建议在漂洗后甩干，及加入洗脱液后离心这两步，尽可能使用高速离心，以节约甩干后干燥时间，以及大幅度提高洗脱效率。
3. 菌液培养条件、菌液用量相关培养基选择：
• 小量质粒提取：可以使用 LB 培养基或 2YT 培养基。
• 中/大量质粒提取：优先选用 2YT 培养基。
培养条件：
• 采用小体积培养基+高转速培养确保溶氧量。
• 建议预实验：取 2ml 菌液小提验证质粒质量及产量。
质粒提取时菌液用量建议：
• LB 培养基 100-200 mL；2YT 培养基 50-100 mL。
• 使用过多的菌液，会导致质粒产量降低，质量下降。
菌液短期保存：-20℃速冻后转 4℃保存（有效期 2 天）。
4. 菌体裂解注意事项：
• 加入溶液SII 后，可翻转摇匀至澄清透明状，否则菌液过量。
• 加入溶液 SIV 后，要充分混匀，必要时，较用力摇匀。否则后面离心澄清上清时，沉淀不结实，或者成粘团状，上清不易从沉淀中分离出来。
5. 关于裂解指示剂的使用
• 加入裂解指示剂，可以观察菌液裂解及中和时，溶液是否混合充分。如果未能充分混合，则裂解液颜色不均匀，因此建议在操作过程中添加。
• 添加裂解指示剂，不会对提取的质粒质量产生影响。
质粒提取常见问题分析：
1. 质粒产量偏低，浓度过低原因分析：
• 菌体量不足：培养时间短、接种量不足或菌种质量欠佳。
• 质粒拷贝数低：质粒本身拷贝数低或宿主菌不适合。
• 裂解不充分：裂解时间短或裂解液浓度不足。
• 质粒丢失：操作过程中发生错误或溶液使用错误。
• 洗脱不充分：洗脱液体积不足或洗脱时间短。
解决办法：
• 增加菌体量：延长培养时间或增加接种量。
• 选择高拷贝质粒或适合的宿主菌。
• 优化裂解条件：延长裂解时间或调整裂解液用量。
• 避免剧烈操作，防止质粒降解。
• 增加洗脱液体积或加入洗脱液后延长放置时间到 10 分钟。
2. 菌体裂解后过于粘稠，不易离心原因分析：
• 菌体使用过量：使用了过多的菌液，或菌液放置时间过长。
• 裂解操作不到位：加入溶液SIV 后未充分混匀。
解决办法：
• 减少菌体量：使用合适的菌液量提取质粒。
• 按照前面质粒提取注意事项第 3 第 4 条，合理操作。
3. 质粒提取后电泳条带异常，出现多条带，出现 RNA 干扰带原因分析：
• 质粒构型多样：超螺旋、线性、开环质粒共存。
• 质粒二聚体或多聚体：质粒在提取过程中形成多聚体。
• 宿主基因组 DNA 污染：裂解过度或操作幅度过大。
• 有 RNA 残留：溶液 SI 放置过久，RNA 酶活性降低。
解决办法：
• 分析质粒构型：必要时将质粒酶切后再电泳检测。
• 优化菌体生长条件及提取条件，减少质粒多聚体形成。
• 控制裂解条件：使用合适的菌液量，轻柔操作，避免基因组 DNA 对质粒提取的影响。
• 合理使用 RNA 酶：大提质粒时，一般不将 RNase A 加入到溶液 SI 中，而是在加入溶液 SIV 步骤后面，直接加 RNase A，可以显著提高 RNA 酶活性，减少 RNA 对质粒提取的影响。