增强型无内毒素质粒大量制备试剂盒

（离心柱型离心法）

BK2109：2次 / 10 次

试剂盒组成

注意事项：

*平衡液CBS：用于活化吸附柱硅胶膜，提升质粒结合效率。

*漂洗液WS：使用前按 1:4比例 加入无水乙醇(或95%乙醇)。

*工业大包装规格，请单独询价。

产品特点简介：

l 高效吸附：硅胶膜吸附柱容量 1000-4000 μg，视质粒拷贝数及大小有较大差别。

l 高纯度低内毒素：提取质粒内毒素水平 <0.05 EU/μg（以中高拷贝质粒为例），显著优于常规方法（>1000 EU/μg）。

l  快速流程：结合碱裂解与膜吸附技术，操作全程约 2~3 小时。

l  灵活兼容：可以兼具角转子的高速离心和水平转子的高通量。

保存与运输：

l  RNase A：2~8℃保存，常温运输（长期存放需-20℃）。大提质粒时，通常将 RNase A 的添加步骤调整至溶液 SIV加入之后即时添加，可显著提升 RNA 的降解效率，减少后续 RNA 残留对质粒提取的影响。

l  其它组分：室温（15-25℃）稳定保存 18 个月；高温环境或长期保存，建议 2-8℃保存。

l  运输条件：常温运输，高温季节建议添加冰袋。

u 实验前准备：

l  首次使用前，请仔细完整阅读说明书。

l  检查漂洗液 WS 是否按 1:4 比例添加入乙醇。

l 室温较低时，若溶液 SII 出现沉淀，37℃加热溶解后冷却至室温使用。

l  使用新鲜过夜培养的菌液（推荐 2YT 培养基）。

快速操作指南(Quick Guide)

注：以下操作以角转子离心为基准。使用水平转子离心，参数见括号内标注。

Ø 菌体收集、裂解与澄清

1.    菌体收集： 通过多次离心收集所需要的菌体量。

取 50-200 mL 菌液（LB 培养基 100-200 mL；2YT 培养基 50-

100 mL），6000×g 离心 3 分钟（水平转子：4000rpm，10分钟），弃上清。

2.    重悬菌体：加入 10 mL 溶液 SI，振荡至无可见菌块。

（选做）可在此步加入 50ul Visual Blue，用于指示菌液裂解。

3.    裂解处理：加入 10 mL 溶液 SII，轻柔翻转混匀 4-10 次，形成透明裂解液（≤5 分钟）。

4.    中和并澄清沉淀：加入 8 mL 溶液 SIV，100 µL RNase A，翻转混匀 8-10 次，室温静置 10 分钟，10000×g 离心 5 分钟

（水平转子：4000rpm，5 分钟）。

Ø 内毒素清除

5.    使用过滤器将上清液过滤至 50 mL 尖底离心管（可得约 25-

27 mL 上清），加入 3 mL 溶液 GETR，翻转混匀。

6.    可选步骤：冰水浴 3-5 分钟（能适当提高内毒素清除率）。

7.    42℃水浴 3-5 分钟至溶液浑浊，离心分层（室温 10000×g，

5 分钟）(水平转子：4000rpm，5 分钟)。然后静置 5~10 分钟，使分层清晰。

8.    小心将上清倾倒至新的 50 mL 离心管，可得约 20ml 溶液。根据实际体积，准确加入 40%比例的溶液 eDBS，混匀备用。

Ø 质粒纯化

9.    吸附柱平衡：（建议在处理上清液期间处理）向 GP6 柱加 4 mL 平衡液 CBS，静置 2 分钟，6000×g 离心 2 分钟，弃废液。

10.  吸附柱吸附质粒：步骤 8 所得混合液， 通过多次离心，将样品吸附到 GP6 柱中。混合液用量≤9 mL/次，6000×g 离心 2分钟。（水平转子：≤15ml/次，4000rpm，1 分钟）。

11.  漂洗：依次加入 8 mL 溶液 eDBS、8 mL 漂洗液 WS（两次），每次 6000×g 离心 2 分钟（水平转子：4000rpm，1 分钟）。

12.  干燥：10000×g 空离 5 分钟，并室温放 5 分钟彻底去除乙醇。

（水平转子：4000rpm，5 分钟，50℃放置 10 分钟）

Ø 质粒洗脱

13.  加入 1.2 mL 洗脱缓冲液 eEB，室温静置 5 分钟，10000×g

离心 3 分钟收集洗脱液。

（使用水平转子：加 1.5 mL eEB，室温放置 5~10 分钟， 4000rpm，5 分钟。并将洗脱液加到膜上，重复洗脱一次以提高洗脱效率）

14.  二次洗脱：根据实验需要，可按步骤 13 做第二次洗脱，并独立收集洗脱液，备用。一般二次洗脱可回收的质粒量参考。角转子高速离心回收：20%~30%。

水平转子低速离心回收：20%~50%。

Ø 质量检测

电泳检测：测量浓度，并取 1-3 μL 样品进行琼脂糖凝胶电泳（建议稀释后检测，DNA 总量不超过 500ng）

保存建议：-20℃长期保存，避免反复冻融。

质粒提取注意事项：

1.   吸附柱 GP6 处理注意事项：

• GP6 柱预处理：使用前需经柱平衡液处理，可显著提升质粒吸附效率和柱体可靠性。

•  操作时机：建议与上清液做内毒素清除步骤同步进行。

2.   关于离心相关注意事项

•  角转子：离心效果好，尤其是洗脱环节，但是通量较低。

•  水平转子：通量大，但需延长离心时间补偿离心力不足。

•  如果处理的样品数量较大，建议角转子离心机与水平转子离心机搭配使用，以发挥各自优势。

•  如果条件允许，一般建议在漂洗后甩干，及加入洗脱液后离心这两步，尽可能使用高速离心，以节约甩干后干燥时间，以及大幅度提高洗脱效率。

3.   菌液培养条件及用量相关培养基选择：

•  小量质粒提取：可以使用 LB 培养基或 2YT 培养基。

•  中/大量质粒提取：优先选用 2YT 培养基。

培养条件：

•  采用小体积培养基+高转速培养确保溶氧量。

•  建议预实验：取 2ml 菌液小提验证质粒质量及产量。

质粒提取时菌液用量建议：

• LB 培养基 20-40 mL；2YT 培养基 15-20 mL。

•  使用过多的菌液，会导致质粒产量降低，质量下降。

菌液短期保存：-20℃速冻后转 4℃保存（有效期 2 天）。

4.   菌体裂解注意事项：

•  加入溶液SII 后，可翻转摇匀至澄清透明状，否则菌液过量。

•  加入溶液 SIV 后，要充分混匀，必要时，较用力摇匀。否则后面离心澄清上清时，沉淀不结实，或者成粘团状，上清不易从沉淀中分离出来。

5.   内毒素清除环节注意事项处理流程：

•  上清液加入内毒素清除剂 GETR 后，一般直接进行加热处理分相即可。如果为了更彻底的去除内毒素，在加入 GETR 溶液后，可以做一步冰水浴处理。

•  离心分相后，需要静置 5~10 分钟，使大部分有机相液滴沉于离心管底部，便于后面操作。

上清水相转移方式：

• 5~10ml 以下的较小体积，建议直接用移液器吸取。

• 10ml 以上的较大体积，直接倾倒（注意不要倒出下层相）。

6.   关于质粒洗脱

•  除非预期质粒产量低于 1mg，一般值得再做一次质粒洗脱，并单独收集，视第二次洗脱浓度决定后续使用。

•  质粒洗脱时，使用尽可能大的离心力以提高洗脱效率。

质粒提取常见问题分析：

1.     质粒产量偏低，浓度过低原因分析：

•  菌体量不足：培养时间短、接种量不足或菌种质量欠佳。

•  质粒拷贝数低：质粒本身拷贝数低或宿主菌不适合。

•  裂解不充分：裂解时间短或裂解液浓度不足。

•  质粒丢失：操作过程中发生错误或溶液使用错误。

•  洗脱不充分：洗脱液体积不足或洗脱时间短。

解决办法：

•  增加菌体量：延长培养时间或增加接种量。

•  选择高拷贝质粒或适合的宿主菌。

•  优化裂解条件：延长裂解时间或调整裂解液用量。

•  避免剧烈操作，防止质粒降解。

•  增加洗脱液体积或延长洗脱时间。

2.     菌体裂解后过于粘稠，不易离心原因分析：

•  菌体使用过量：使用了过多的菌液，或菌液放置时间过长。

•  裂解操作不到位：加入溶液SIV 后未充分混匀。

解决办法：

•  减少菌体量：使用合适的菌液量提取质粒。

•  按照前面质粒提取注意事项第 3 条，合理操作。

3.     质粒提取后电泳条带异常，出现多条带，出现 RNA 干扰带原因分析：

•  质粒构型多样：超螺旋、线性、开环质粒共存。

•  质粒二聚体或多聚体：质粒在提取过程中形成多聚体。

•  宿主基因组 DNA 污染：裂解过度或操作幅度过大。

•  有 RNA 残留：溶液 SI 放置过久，RNA 酶活性降低。

解决办法：

•  分析质粒构型：必要时将质粒酶切后再电泳检测。

•  优化菌体生长条件及提取条件，减少质粒多聚体形成。

•  控制裂解条件：使用合适的菌液量，轻柔操作，避免基因组 DNA 对质粒提取的影响。

•  合理使用 RNA 酶：大提质粒时，通常将 RNase A 的添加步骤调整至溶液 SIV 加入之后即时添加，可显著提升 RNA 的降解效率，减少后续 RNA 的大量残留对质粒提取的影响。