无内毒素质粒大量制备试剂盒

（增强离心柱型）

BK2110 2次/10次

试剂盒组成

u 自备试剂、设备及耗材等

l  无水乙醇（配漂洗液WS 用）

l  50ml 离心管若干（收菌及处理上清），建议用 KG2811

l  可使用 50ml 离心管的水平离心机，转速可达 4000rpm

l  5ml 或 10ml 移液器及枪头（全程操作以移液器取液为主）

u 实验前准备：

l  第一次使用产品前，请仔细阅读说明书。

l  检查漂洗液WS 是否按照要求加入乙醇。

l  室温较低时，请检测溶液 SⅡ中是否有沉淀。若有沉淀，请于 37℃保温溶解，待恢复到室温后使用。

l  过夜培养的状态良好的菌液。

u 菌液培养及用量：

l  质粒提取量的多少，除了质粒拷贝数的特性外，菌液培养的状态也是影响质粒提取量的重要因素。

l  使用较少的培养基和较高的转速保证培养液的通气条件，是菌液生长良好的关键因素。

l  强烈建议先取 2ml 菌液做小提质粒，检测一下质粒的含量及质量，看是否适合用于质粒大量提取。

l  做质粒的中量及大量提取时，我们建议使用 2YT 这类营养丰

注：

*平衡液CBS用于质粒提取前柱子的平衡处理，可以活化硅胶膜，有利于提高质粒的产量。

*漂洗液WS在使用前应按1:4比例加入乙醇。

u 产品特点简介：

l  吸附柱容量：1000~3000ug（不同大小质粒有差异）。

l  本试剂盒采用碱裂解法分离质粒，通过优化溶液体系，并结合膜吸附技术特异性吸附质粒，可以获得高产量、低内毒素水平的质粒，具有高效、快速、方便、经济实惠的特点。

l  一般常规试剂盒提取的质粒内毒素水平会超过 1000EU/ug。而使用本试剂盒可获得很好的满足转染等实验要求的无内 毒素质粒，如对于中高拷贝数的质粒，内毒素水平一般

<0.1EU/ug。

u 保存温度：

l  RNase A：建议 2~8℃保存，长期保存可置于-20℃保存。室温(25℃)可稳定保存一个月以上。

l  大提质粒不建议将 RNase A 加入到溶液 SI 中，而是改为提取质粒时，加到溶液SIV 步骤后面，可以充分发挥 RNase A的活性，最大限度降低 RNA 对后面质粒提取的影响。

l  试剂盒其余组分于室温（15℃~25℃）可以稳定存放 1.5 年而使用活性无明显衰减。室温过高或需要更长期保存，请放置于 2~8℃。

u 运输温度：

l  室温运输。如果温度高于 30℃，请酌情放置冰袋运输。

富的培养基，可以获得较高的菌体浓度。

l  一般使用LB 培养基时，我们建议使用 100ml~200ml 菌液。使用 2YT 培养基时，最多使用不超过 100ml 菌液，或者每管收集菌体的湿菌重量不超过 1.0 克，否则会导致菌液裂解不充分而影响质粒质量及产量，降低超螺旋质粒的比例。

u 菌液暂存条件：

l  如果菌液不能立即用于质粒提取，可先将菌液放置于-20℃，快速的将菌液温度降至 0℃左右，然后转入 4℃存放。保存的菌液在两天之内用于质粒提取，不会明显影响提取的质粒质量。

u 溶液eDBS使用注意事项：

l  溶液eDBS 用于将质粒结合到柱子上，正确使用非常关键。

l  首先要准确估算上步得到的上清液体积，一般使用一个刻度比较准确的 50ml 离心管来估算体积。

l  其次，准确加入 40%体积比的eDBS，尤其要注意枪头中残留的没有加到溶液中的死体积。如有必要，将移液器调大一个刻度，将这些死体积考虑进去。

l  在实验操作步骤 10 中，按照正确的比例准确加入 eDBS 很重要。很多时候提取的质粒量与期望值相差放多，多半问题都发生在这一步。

使用水平离心机快速操作指南

以下是以常用的可以达到 4000rpm 速度的水平离心机做参考。本试剂盒配备的DNA 吸附柱 GP7 由于角度问题，需使用水平离心机操作，不适合角转子离心机。

Ø DNA 吸附柱平衡处理

1.    将吸附柱 GP7 放于 50ml 收集管中，向吸附柱中加入 4ml平衡液 CBS，将其快速离心到约 500rpm，静置 5~10min，让溶液充分浸润吸附膜。然后 4,000rpm 离心 3min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中备用。

注意事项：

l请使用当天处理过的 DNA 吸附柱。

l瞬时离心，可以使平衡液 CBS 充分浸润到吸附膜中。

Ø 菌体收集

2.    根据菌液生长的状态，使用自备 50ml 离心管，取适当量过夜培养的菌液，4000rpm 离心 10min，收集菌体，并倒尽上清。

注意事项：

l根据试剂盒首页说明收集适量菌液，用于质粒提取

l对于较低拷贝数的质粒，可以考虑平行做 2 份菌液，处理所得上清最后通过多次离心收集到一个吸附柱中，以增加产量。

Ø 菌体收集及裂解

3.    加入 12ml 溶液 SI，用振荡器充分悬浮细菌。注意事项：

l不要残留细小菌块，否则会影响裂解，导致质粒量低和质量下降。

l此步可加入 50µl Visual Blue 指示剂，用于监控后面处理是否充分。

4.    加入 12ml 溶液 SII，立即温和并充分地上下翻转混合 4-6次，使菌体充分裂解，直至形成均匀透亮的溶液，此步骤不宜超过 5min。

5.    加入 9.6ml 溶液SIV，温和并充分地上下翻转混合 8～10 次，然后向每管加入 100µl RNase A，室温放置 10min。然后 4,000rpm 离心 8min。

注意事项：

l充分中和的上清液，应生成大量的白色絮状沉淀，且没有局部粘稠物存在。

l如果在第 3 步加了 Visual Blue 指示剂，则此步溶液蓝色完全消失。

l如果RNase A 已经预先加到了溶液 SI 中，则此步无需再加 RNase A。

Ø 收集上清液并进行内毒素清除操作

6.    准备一个新的过滤器，拔掉推杆，放于 50ml 离心管口，然后小心的将第 5 步离心得到的上清液倒入过滤器，重新插入推杆，小心推动推杆，将上清液过滤到 50ml 离心管中。此步骤能够得到约 30~32ml 上清液，然后加入 3ml GTER 溶液，并颠倒混匀。然后于冰水浴中冷却 5~10min，期间可以颠倒摇匀几次，使GETR 与内毒素充分接触。冷却后的溶液变成蓝色透明状。GETR 溶液比较粘稠，注意缓慢加入以保证加入比较准确的体积。

7.    将上一步的溶液转到 42℃水浴中，放置 5min，溶液重新变浑浊，甚至蓝色有机相会部分聚集到管底。

8.    4,000rpm，室温离心 5min，溶液将分为无色的上层水相和蓝色的下层有机相。由于离心速度限制，溶液分层可能不是非常清晰。将离心管静置 5~10 分钟，溶液将分层更清晰。

9.    注意事项：

l下层溶液离心后体积会变大，属正常现象，不会造成质粒损失。

10.  将上层溶液转移到一个新的 50ml 带刻度离心管中。该步操作，可以小心的直接将上清慢慢倒入新离心管中，一般下层蓝色有机相比较粘稠，熟练操作时，一般不会随上层水相倒出来。

11.  根据离心管的刻度估算倒出来的上清液体积，准确加入 40%体积的 eDBS 缓冲液，转入到正常的质粒提取环节即可

注意事项：

l 此步准确的估计上清液体积并按照 40%比例加入溶液eDBS 很重要。 eDBS 加入不足，会严重影响质粒产量，反之，过大比例的 eDBS 会导致提取的质粒中中有较多的 RNA 干扰，造成浓度虚高。

Ø 质粒吸附、漂洗

12.  将步骤 10 得到的滤液，分多次转移至吸附柱 GP7 中进行质粒 DNA 吸附。每次吸取不超过 20ml 滤液加入吸附柱， 4,000rpm 离心 2min。多次操作，直到所有溶液都通过吸附柱 GP7。

13.  将 DNA 吸附柱重新放回收集管中，加入 10ml 溶液 eDBS，

4,000rpm，室温离心 2min，倒掉收集管中废液。

14.   将吸附柱重新放回收集管中， 加入 10ml 漂洗液 WS，

4,000rpm，室温离心 2min，倒掉收集管中废液。

15.  重复步骤 13 一次。

Ø 空甩甩干

16.  倒掉收集管中废液，4,000rpm，室温离心 5min，彻底去除漂洗液 WS（此步骤不可省略）。然后将吸附柱 GP7 放入一个新的 50ml 收集管中（试剂盒中标配的），开盖室温或 37℃放置 5min，以晾干吸附膜中残留的漂洗液 WS。

Ø 质粒洗脱

17.  在吸附柱的膜中央加入 1.5ml 洗脱缓冲液 EB，室温或者

37℃放置 5~10min，以充分浸润吸附膜。

18. 4,000rpm，室温离心 3min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液。

洗脱质粒注意事项：

l质粒洗脱这一步，加入足量的洗脱缓冲液 EB 比较重要。应确保加入洗脱液后吸附膜表面呈现湿润的状态，否则需要再补加洗脱缓冲液。一般 1.2~1.5ml 洗脱缓冲液的体积是足够的。

l加入洗脱液后，放置充足的时间，是将质粒从膜上洗脱下来的关键。

l一般将第一次洗脱能够洗下来的溶液重新吸到膜上，进行第二次洗脱，可以提高 10%~20%的回收率。

l如果第一次洗脱的质粒浓度超过 1500ng/ul，有必要再洗脱一次质粒，并独立收集，通常洗脱液中还会有较高浓度质粒。

Ø 质量检测

19.  测定质粒浓度，并取 1～3µl（视质粒浓度定）进行琼脂糖凝胶电泳，检测所提质粒的质量。纯化好的 DNA 可立即用于后续实验或-20℃冻存。

注意事项：

l如需电泳检测质粒超螺旋等情况，建议质粒加样量不超过 500ng。电泳时加入过多的质粒，会跑成一片，无法评估质粒质量。