BioTNT的小鼠端粒酶活性检测试剂盒(TERT mRNA染料法) (mouse Telomerase Activity Assay Kit by SYBR Green qPCR for TERT mRNA)，又称qPCR染料法小鼠端粒酶催化亚基mTERT检测试剂盒(mouse Telomerase Reverse Transcriptase Subunit Assay Kit by qPCR with SYBR Green)，或mTERT qPCR检测试剂盒(mTERT qPCR Assay Kit)，是一种基于端粒酶催化亚基TERT基因和内参基因GAPDH的特异性引物，快速、灵敏地检测小鼠细胞或组织内端粒酶催化亚基(mTERT)表达量从而间接衡量端粒酶活性的试剂盒。

本试剂盒以端粒酶的TERT基因和内参GAPDH基因的mRNA作为检测靶点，提供了优化的反转录引物(Specific RT Primers (10X)、TERT Primer Mix (10X)和GAPDH Primer Mix (10X)，同时提供了qPCR实验所需的预混液SYBR Green qPCR Mix (2X)。

本试剂盒提供了Low ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。检测次数为总次数，包括使用端粒引物和内参引物体系及样品和阴性对照的测试。

包装清单： 

保存条件： 

-20ºC保存，一年有效。其中SYBR Green qPCR Mix (2X)须避光保存，并尽量避免反复冻融。

注意事项： 

1. 使用前需确保试剂完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

2. SYBR Green qPCR Mix (2X)中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

3. qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

4. 建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。

5. 本产品仅限于专业小鼠的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 需要用户自备的耗材、仪器和试剂。
a. 荧光定量PCR仪。
b. DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜等。
c. A2010A0601 cDNA第一链合成/RNA逆转录试剂盒 (50T)。
2. 总RNA抽提与反转录。
a. 提取细胞或组织样品的总RNA。
使用trizol法或者磁珠法，离心柱法提取细胞或组织样本RNA，提取后推荐使用DNase I处理，以去除RNA样品中可能的基因组DNA污染。提取获得的RNA样品，其A260/280通常应在1.9-2.0之间。
b. RNA反转录使用A2010A0601 cDNA第一链合成/RNA逆转录试剂盒 (50T)。
推荐使用，取1μg总RNA进行反转录反应。
(a) 参考下表设置反转录反应：

(b) 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
(c) 在PCR仪中反应，程序设置为42ºC 60分钟。
(d) 反转录产物可以直接用于后续的qPCR反应，也可以-20ºC冻存以备以后使用。
3. qPCR反应体系的设置。
a. 融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
b. 参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20µl为例)。下表中的Template为样品、阴性对照(Negative Control)。Negative Control可使用ddH2O。建议每次检测都设置Negative Control。
注1：对于每个样品，都需要准备2个反应体系，分别用于端粒引物(TERT Primer)和内参引物(GAPDH Primer)。

以下为基本的反应体系配置：

预混液具体配置方法：

先配置引物mix；根据要检测的样本数量n，配置n+2的反应体系；举例，如果要检测的样本数量为5，需要做3重复，则配置 5*3+2 共17孔的反应体系；

1.配17*（10ul mix+0.4ulmTERT上游引物+0.4ulmTERT下游引物）的预混液1；

2.配17*（10ul mix+0.4ulGAPDH上游引物+0.4ulGAPDH下游引物）的预混液2；

3.  5个样本，每个样本做6孔，按照7孔的量来分别配置 CDNA+水的样本稀释液，就是7*（1ul CDNA+8.2ul 水）=7ul CDNA+57.6ul 水，记录样本编号为1到5；

c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

加样：把预混液加入96孔PCR 反应板中：

按照每孔加入10.8ul 预混液1的方式，加入16孔mTERT的预混液,如下图CDE三行所示；

按照每孔加入10.8ul 预混液2的方式，加入16孔mGAPDH的预混液，,如下图FGH三行所示；

纵向5列每列加入6孔,每孔加入9.2ul样本稀释液，分别标记为样本1，样本2，样本3，样本4，样本5，第6列加入ddH2O  9.2ul ；

 
d. 加入板中，用光学膜把板封好。放入微孔板离心机甩一下，进行离心。也可以不用PCR 板，用PCR 8联管进行反应。注意仪器与板或者管子的适配。将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，进行仪器设置。
4. qPCR反应程序。
本试剂盒建议采用如下的qPCR程序，本程序是以QuantStudio™ 3 Systems荧光定量PCR仪为例：
a. 预变性：95ºC 5分钟；
b. 变性：95ºC 5秒；
c. 退火/延伸：60ºC 30秒（注意，在这个位置进行荧光检测）；
d. 重复步骤c和步骤d，总共40个循环；
e. 熔解曲线分析：95ºC 15秒, 60ºC 15秒, 95ºC 15秒；进行荧光检测；
f. 最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果。
5. 结果的定性判断和相对定量。
a. 阴性对照(Ultrapure Water)：TERT基因无典型S型扩增曲线或Ct值≥35，内参GAPDH基因无典型S型扩增曲线或Ct值≥35。
b. 端粒酶活性阳性：待测样本检测结果TERT基因Ct值＜35且扩增曲线正常，内参GAPDH基因在15±3，且阳性对照品检测结果为阳性，阴性对照品检测结果为阴性，此次结果判断为端粒酶活性阳性。
c. 端粒酶活性阴性：待测样本检测结果TERT基因无典型S型扩增曲线或Ct值≥35，内参GAPDH基因在15±3，且阳性对照品检测结果为阳性，阴性对照品检测结果为阴性，此次结果判断为端粒酶活性阴性。
d. 如果样品不是阴性，此时不同样品之间可以通过2^-ΔΔCt (ΔΔCt为两个样品间的Ct值差值)公式进行相对定量，以比较不同样品之间的TERT mRNA水平的变化，用于判定端粒酶活性水平的高低，计算方法如下。
据端粒引物(TERT Primer)和内参引物(GAPDH Primer)扩增Ct值计算样品的之间TERT mRNA水平的变化：
(a) 样品1的ΔCt (Sample 1)＝Ct (TERT, Sample 1)-Ct (GAPDH, Sample 1)
(b) 样品2的ΔCt (Sample 2)＝Ct (TERT, Sample 2)-Ct (GAPDH, Sample 2)
(c) 样品间ΔΔCt＝ΔCt (Sample 2)-ΔCt (Sample 1)
(d) 样品2相对于样品1的TERT mRNA相对变化=2^-ΔΔCt

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