使用举例:
Human TRANCE/RANK L/TNFSF11 (Catalog Number: DY626)为例:
如果客户购买 RND systems 的 duoset 未包被 ELISA kit,试剂盒提供: CaptureAntibody (1 vial) ,Detection Antibody (1 vial) ,Standard, Streptavidin-HRP (1 vial);
BioTNT 提供的 ELISA 包被经济套装 3 EL-CPX 提供了包被需要的绝大多数试剂;经测试,比原试剂盒提供的缓冲液配方可以显著提高试剂盒的灵敏度,结合冻干工艺,可以达到良好的稳定性;并显著降低试剂盒的本底;
包被和检测实验示例:
一、包被液的配制:
coating buffer 包被缓冲液(EL-CPX01):该试剂为 10X 浓缩液,使用前请根据实验用量,用蒸馏水稀释至 1X,即配即用,例:10ml coating buffer + 90ml蒸馏水;
Coating buffer 用于抗体的包被;可替代以 PBS 为主的包被液体;请用 1* Coating buffer 和适量抗体配成包被液,抗体浓度请参考抗体的说明。
二、包被实验示例:
在 ELISA 酶标板(EL-CPX02)中每孔加入 100ul 包被液(包被液若有剩余可多包被一点,以条为单位),在板上贴膜或者盖上盖子(防止异物进入板孔),室温(控制室温在 25℃,板放置处旁放置温度计控温)温育过夜(下午 4 点到第二天早上 9 点,不宜缩短时间,会降低包板效率);结束温育(也请参考抗体说明书的包被条件进行相应调整)。多余的配好的包被液不能保存。
三、洗板封闭:
1) 将洗液 20×Wash Buffer(EL-CPX09)配制成 1×Wash Buffer(实验前请合理计算用量,配制成足够的量待用),用 1×Wash Buffer 洗板 4 次(注:包被组分在加稳定剂前不能剧烈震荡或完全干燥,所以洗板过程需快速、温和,不要拼命拍板);
2) 洗板后立即加入 200ul 每孔的酶标板稳定剂(EL-CPX03),在板上贴膜 (EL-CPX11),37℃温育 1 小时;
3) 弃掉或吸取酶标板稳定剂(注:拍干,千万不要洗板)。封闭好的酶标板可以有以下几种处理方式。
方式一:直接进行检测;
方式二:1) 冻干成品:把酶标板放入冰箱,-20℃冰箱冷冻过夜。
2) 调试真空冻干机,立即将冷冻过夜的酶标板放入真空冻干机冻干 24 小时;
3) 取出冻干的酶标板,立即将酶标板放入一个装有干燥剂的铝箔袋内(EL-CPX10),贴上标签,放 4℃冰箱长期保存。(冻干同时可进行标准品冻干)。
注意 备注: 如果酶标板不直接进行检测,必须采用进行干燥。干燥后的酶标板才可以稳定保存。一周内检测的酶标板可以冻存,不冻干。
四、检测方法示例
(请参考抗体说明,安排相应的检测方法,根据您的实验路线,如果是双抗夹心法,可以选择酶标二抗,也可以选择生物素二抗,采用生物素-亲和素的放大系统):
实验示例:下面是双抗夹心法的实验示例:
1) 以上的酶标板已经预包被了抗体,选取相应的板条;
2) 标准品请用相应的稀释液稀释;如检测的是血清,标准品用 EL-CPX08 稀释;如果检测的是细胞上清样品或其他非血清样品,请用 EL-CPV03(需另购)稀释标准品;样本可以选择几个样本,做原倍不稀释,两倍稀释,10 倍稀释等梯度;
3) 酶标板中加入适量稀释好的标准品和样品,各100ul;
4) 37 度温育1到2 小时;
5) 洗板四次(洗液同上);
6) 生物素二抗请根据说明书,用生物素(Biotin)稀释液(EL-CPV04)进行稀释;
7) 37 度温育 30 分钟;
8) 洗板四次;
9) 酶标二抗,请用(EL-CPV05)稀释;
10) 每孔加入 100ul 稀释好的酶标二抗,37 度温育 1 小时或其他时间;
11) 洗板四次;
12) 加入显色液:显色液 A,B(Substrate A,B)(EL-CPI03);使用前请按按照A 液和B液 1:1 比例充分混匀,方可使用,使用前 15 分钟配置;每孔加入 50ul-100ul 混合后的显色液;室温温育 10-30 分钟:显色时间根据目测最高浓度标准品的颜色,应为深蓝色,630 读数,OD 值应在 0.7 以上;
13) 加入终止液(Stop Solution)(EL-CPI04)100ul 每孔。加入终止液 50ul-100ul,显色从蓝色转为黄色。建议采用 450-630 的双波读数。
注:根据实验设计不同的包被浓度,酶标二抗浓度,HRP 浓度,反应时间等变量,找到最优化的实验条件。确定试剂盒定量范围、灵敏度等试剂盒特性。
双抗夹心法可以回归为线性、二次曲线,或者四参数曲线;竞争法可以回归为 log-logit,或者四参数曲线;
五. 包被实验的验证实验设置
与预包被的elisa 实验不同,包被实验需要在第一次实验的实验验证如下实验情况:
1.确定一抗的包被浓度;一般来说试剂盒如果提供了浓度,就按照浓度来设置,如果没有提供的话,就按照经验来包被;
2.设定正交实验,确定标准曲线的范围,一般是倍半稀释拉梯度,8个或者更多,根据试剂盒提供的参数,可以选择拉8个梯度或者10个,如果没有提供参数,建议可以增加到16个梯度;
3.确定biotin二抗的稀释比;一般可以选择两个梯度来比较实验结果;
4.确定HRP的稀释比;一般可以选择两个到三个梯度来进行稀释;
5.根据正交实验结果来确定最终参数的选择,以及试剂盒的灵敏度和定量范围;
6.根据确定下来的参数,如标准品的浓度,定量范围,二抗的稀释比,HRP的稀释比,分装和冻干标准品;进行样本测试,得到试剂盒的板内差数据(CV值);(冻干服务和详细的板内差CV测试不包含在1000元的服务内,属于增值服务);