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Western Blotting

 

Western blotting 实验流程:

样本处理→→蛋白定量→→样本均一化→→制胶→→上样→→电泳→→转膜→→染膜→→膜的切割→→封闭→→杂交上一抗→→二抗→→显色→→曝光→→数据处理→→膜的再生

 

 

BioTNT western blotting(免疫印迹)试剂按照实验流程进行排列:

 

实验流程 品名 货号 规格

价格

样本处理

单去污剂裂解液

A20120A0101

50ml

¥120

磷酸化蛋白和蛋白酶抑制剂cocktail

A20120A0105

1ml(100*)

¥350

PMSF

A20120A0105-2

10ml200mM

¥100

蛋白定量

BCA 蛋白定量测试盒  500微孔

1-PC0020

500微孔

¥350

制胶(小量推荐)

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

A20120A0300

50T

¥350

制胶(超过50张膜--大量推荐)

Tween   20 

1-T8220-100ml

100ml

¥40

吐温-20

1-T8220-500ml

500ml

¥100

甲叉双丙烯酰胺(BicNN-Methylenebisacrylamide     Bis-acrylamideNN-亚甲基双丙烯酰胺

2-M6024-25G

25g99%电泳级)

¥79

甲叉双丙烯酰胺(BicNN-Methylenebisacrylamide     Bis-acrylamideNN-亚甲基双丙烯酰胺

2-M6024-100g

100g99%电泳级)

¥232

甲叉双丙烯酰胺(BicNN-Methylenebisacrylamide     Bis-acrylamideNN-亚甲基双丙烯酰胺

2-M6024-250g

250g99%电泳级)

¥462

Acrylamide(丙烯酰胺)

2-A6299-25g

25g99%电泳级)

¥46

Acrylamide(丙烯酰胺)

2-A6299-500g

500g99%电泳级)

¥196

Acrylamide(丙烯酰胺)

2-A6299-5kg

5kg99%电泳级)

¥686

TEMED 四甲基乙二胺 

2-N818999-5ml

5ml

¥26

TEMED 四甲基乙二胺 

2-N818999-25ml

25ml

¥40

Tris•HCl    1.5mol/LpH8.8

A20120A0203

100ml

¥60

Tris•HCl    0.5mol/LpH6.8

A20120A0204

100ml

¥60

上样

还原型SDS-page上样缓冲液5X  

A20120A0210

5ml

¥60

蛋白分子量Marker

预染蛋白分子量标准(10-170kDa

3-26617

250ul   for 125

¥300

电泳和转膜(小量推荐)

电泳缓冲液

A20120A0209

可配制 10L

¥120

Western 转膜液

A20120A0208

可配制 10L

¥120

电泳和转膜(大量推荐)

SDS

1-S8010-100g

100g

¥80

SDS

1-S8010-500g

500g

¥240

Tris 三氨基甲烷

1-T8060-100g

100g

¥80

Tris 三氨基甲烷

1-T8060-500g

500g

¥180

Tris 三氨基甲烷

1-T8060-1kg

1kg

¥320

Tris 三氨基甲烷

1-T8060-5kg

5kg

¥1,500

甘氨酸 

1-G8200-100g

100g

¥30

甘氨酸 

1-G8200-500g

500g

¥80

甘氨酸 

1-G8200-1000g

1000g

¥140

甘氨酸 

1-G8200-5kg

5kg

¥600

膜,滤纸

PVDF0.45um    规格:15x13.5cm

1-YA1701-13.25*15

¥100

PVDF0.22um    规格:15x13.5cm

1-YA1700-13.25*15

¥110

0.45um PVDF 整卷

millipore-IPVH00010

¥2,400

0.45um NC 整卷

millipore-HATF00010

¥2,400

0.22um PVDF膜整卷

millipore-ISEQ00010

¥2,800

3MM滤纸 Whatman

3030-704-27cm×1m

27cm×1m

¥80

3MM滤纸 Whatman

3030-861-100/

100/

¥760

大张滤纸

1-YA0166-60*60cm

60*60cm

¥6

染膜

10X丽春红染液(染膜专用)   

A20120A0207

50ml

¥80

R250考马斯亮蓝染液

A20120A0206  

100mL

¥60

G250考马斯亮蓝染液

A20120A0215

100mL

¥60

TBS缓冲液(浓缩液)

A20120A0211

可配制2L

¥95

TBST缓冲液(浓缩液)

A20120A0212

可配制2L

¥95

封闭

DifcoTM     Skim Milk 脱脂奶粉 

D8340-10g

10g

¥50

DifcoTM Skim   Milk 脱脂奶粉 

D8340-100g

100g

¥160

DifcoTM Skim   Milk 脱脂奶粉 

D8340-500g

500g

¥480

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-5g

5g

¥50

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-10g

10g

¥95

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-25g

25g

¥220

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-50g

50g

¥400

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-100g

100g

¥600

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-500g

500g

¥2,800

牛血清白蛋白 BSA-

A8020-5kg

5kg

¥25,000

杂交

Western 4孔孵育槽(Nunc可节省抗体用量)

A20120A0609

30

Western 5孔孵育槽(国产)

5

¥10

一抗二抗稀释液

A20120A0214

100ml

¥110

抗体稀释液(普通)

A1800-10ml

10ml

¥30

抗体稀释液(普通)

A1800-50ml

50ml

¥70

抗体稀释液(普通)

A1800-100ml

100ml

¥100

标记抗体稀释液

EL-CPV05-10ml

10ml

¥50

HRP标记抗体稀释液

EL-CPV05

50ml

¥240

HRP标记抗体稀释液

EL-CPV05-100ml

100ml

¥400

荧光抗体稀释液

A1840-10ml

10ml

¥30

荧光抗体稀释液

A1840-50ml

50ml

¥70

荧光抗体稀释液

A1840-100ml

100ml

¥100

特异性一抗

内参抗体

GAPDH 内参抗体

A20120A0701

100ul

¥500

beta-actin 内参抗体

A20120A0702

100ul

¥500

二抗

Jackson Goat  Anti-Mouse   IgG(H+L) HRP

A20120A0703

100ul

¥258

Jackson Goat   Anti-Rabbit    IgG(H+L) HRP

A20120A0704

100ul

¥258

Jackson   Rabbit Anti-Goat    IgG(H+L) HRP

A20120A0705

100ul

¥298

Anti-rat IgG(H+L)   HRP

1-SE132-0.1ml

100ul

¥150

羊驼兔抗AlexaFluor 488标记

srbAF488-1-10-b

10ul

¥820

羊驼兔抗AlexaFluor 568标记

srbAF568-1-10

10ul

¥1,480

羊驼兔抗AlexaFluor 647标记

srbAF647-1-10

10ul

¥1,480

羊驼抗小鼠IgG1 Fc特异AlexaFluor 647标记

sms1AF647-1-10

10ul

¥1,480

羊驼抗小鼠IgG2b Fc特异AlexaFluor 647标记

sms2bAF647-1-10

10ul

¥1,480

羊驼抗小鼠IgG3 Fc特异AlexaFluor 647标记

sms3AF647-1-10

10ul

¥1,480

羊驼兔抗AlexaFluor 488标记

srbAF488-1-100

100ul

¥5,340

羊驼兔抗AlexaFluor 568标记

srbAF568-1-100

100ul

¥5,340

羊驼兔抗AlexaFluor 647标记

srbAF647-1-100

100ul

¥5,340

羊驼抗小鼠IgG1 Fc特异AlexaFluor 647标记

sms1AF647-1-100

100ul

¥5,340

羊驼抗小鼠IgG2b Fc特异AlexaFluor 647标记

sms2bAF647-1-100

100ul

¥5,340

羊驼抗小鼠IgG3 Fc特异AlexaFluor 647标记

sms3AF647-1-100

100ul

¥5,340

显色部分

ECL     western blot substrate 

1-PE0010-50ml*2

50ml*2

¥600

Searchlight   Ultra-Sensitive Chemiluminescent   HRP   Membrane/Blotting ECLSubstrate

3-RB-SRCHLGT-1L

1L

¥3,622

Lumigen ECL Ultra   (高敏免疫印迹HRP发光底物)

lumigen-TMA-100

100ml

¥2,666

曝光

X-OMAT   BT 医用X射线胶片,12.7*17.8cm 100/

carestream#6535876

5*7100/

¥200

X光片夹(暗盒)

1-YA0860-5*7

5*7/

¥280

X光片夹(暗盒)

1-YA0861-8*10

8*10/

¥340

显影粉

1-YA0380

1L

¥20

定影粉  

1-YA0370

1L

¥20

其他自配试剂

10 SDS

A20120A0201

100ml

¥100

Tris•HCl    1.0mol/LpH8.0

A20120A0202

100ml

¥60

Tris•HCl    1 mol/ LpH7.5

A20120A0205

100ml

¥60

考马斯亮蓝G- 250(蛋白定量用)

1-PC0015-100ml

100ml

¥120

考马斯亮蓝G- 250(蛋白定量用)

1-PC0015-500ml

500ml

¥480

 

 

 

 




 

 


品牌 货号 品名 规格 特性 价格
BioTNT 特异性一抗 询价
询价
BioTNT 1-G8200-1000g 甘氨酸  1000g ¥180
¥140
BioTNT 1-G8200-100g 甘氨酸  100g ¥40
¥30
BioTNT 1-G8200-500g 甘氨酸  500g ¥100
¥80
BioTNT 1-G8200-5kg 甘氨酸  5kg ¥780
¥600
BioTNT 1-PC0015-100ml 5×考马斯亮蓝G- 250(蛋白定量用) 100ml ¥160
¥120
BioTNT 1-PC0015-500ml 5×考马斯亮蓝G- 250(蛋白定量用) 500ml ¥620
¥480
BioTNT 1-PC0020 BCA 蛋白定量测试盒  500微孔 500微孔 ¥460
¥350
BioTNT 1-PE0010-50ml-2 ECL western blot substrate 50ml*2 ¥780
¥600
BioTNT 1-S8010-100g SDS 100g ¥100
¥80
BioTNT 1-S8010-500g SDS 500g ¥310
¥240
BioTNT 1-SE132-0.1ml Anti-rat IgG(H+L) HRP 100ul ¥200
¥150
BioTNT 1-T8060-100g Tris 三氨基甲烷 100g ¥100
¥80
BioTNT 1-T8060-1kg Tris 三氨基甲烷 1kg ¥420
¥320
BioTNT 1-T8060-500g Tris 三氨基甲烷 500g ¥230
¥180
BioTNT 1-T8060-5kg Tris 三氨基甲烷 5kg ¥1950
¥1500
BioTNT 1-T8220-100ml Tween 20  100ml ¥50
¥40
BioTNT 1-T8220-500ml 吐温-20 500ml ¥130
¥100
BioTNT 1-YA0166-60*60cm 大张滤纸 60*60cm ¥10
¥6
BioTNT 1-YA0370 定影粉   1L ¥30
¥20
BioTNT 1-YA0380 显影粉 1L ¥30
¥20
BioTNT 1-YA0860-5*7 X光片夹(暗盒) 5*7/个 ¥360
¥280
BioTNT 1-YA0861-8*10 X光片夹(暗盒) 8*10/个 ¥440
¥340
BioTNT 1-YA1700-13.25*15 PVDF膜0.22um    规格:15x13.5cm ¥140
¥110
BioTNT 1-YA1701-13.25*15 PVDF膜0.45um    规格:15x13.5cm ¥130
¥100
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  • western blot 原理

  • western blot 技术服务流程

  • western blot 样本准备


western blot 原理:

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

 

Biotnt  Western blot 实验流程:

蛋白制备及初定量 ---蛋白变性 -------特异蛋白分离----固相载体转移 -------免疫反应 --------发光底物酶促反应----------检测

 

BioTNT  western blot技术优势:

专业技术优势


多重均一化控制


通过对样本测量,蛋白定量,内参控制等手段严格均一化各样本蛋白量,真实呈现蛋白表达差异性。完善产品链条我公司有关于wb试验完整的产品线,从相关试剂耗材到试剂盒,涵盖wb全部试验用品,满足您wb试验各方面需要。

完善western blot产品线:

我公司有关于wb试验完整的产品线,从相关试剂耗材到试剂盒,涵盖wb全部试验用品,满足您wb试验各方面需要。

提供给您实验室全套的western blot 解决方案;

客户western blot 样本要求:


您只需要提供

1.样本要求:尽可能新鲜;

2.样本量:组织样本,质量大于100mg;细胞样本,细胞数大于1×106;

3.您可自备一抗,也可让我公司代买,为保证质量,抗体最好为进口单克隆或多克隆抗体;

4.服务时限和内容:收到样本之日起20-30个工作日内提交实验结果,具体包括实验方法、步骤、所用试剂、仪器、胶片,图片及相关分析数据等;

5.报告送达:实验结果将以电子或书面形式提交给您。

 

 

温馨小贴士

样本制备及注意事项:

悬浮细胞: 取大约 1×107个细胞,低速离心收集,弃去培养液,加入1ml PBS悬浮细胞,转入小离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS,放入-70℃ 冰箱保存。干冰运输。

贴壁细胞:取大约1×107个贴壁细胞,胰酶消化后加入PBS悬浮细胞,低速离心收集,弃去液体,加入 1 ml PBS悬浮细胞,转入小离心管中,低速离心沉淀细胞,弃去PBS,放入-70℃冰箱保存。干冰运输。

组织:采集新鲜组织(注意:生物体死亡后10分钟内取材料并保存好),组织块以PBS或生理盐水清洗干净,切为小块,放入液氮或-70℃冰箱中保存,干冰运输。

 


Introduction

 

本实验是检测蛋白的定性及半定量的技术方法;

实验步骤概述:

1.       确认目的蛋白信息,订购或提供相应一抗;

2.       存于液氮中的组织或细胞用蛋白裂解液(含PMSF,若有磷酸化蛋白,则同时含有磷酸酶抑制剂)进行蛋白的提取;

3.       提出的蛋白用BCA系统进行蛋白初定量;

4.       Western预实验(一个靶标蛋白一张膜预跑);

5.       Western正式实验(优化并固定实验条件,完成所有样本与靶标蛋白);

6.       判断实验结果,灰度值读取,进行半定量计算;

 

Antibody

蛋白信息是从NCBI上面查得;

一抗信息根据相应公司货号查询并下载的protocol

二抗信息如下:Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP (jackson)Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP (HRP) (jackson)Rabbit Anti-Goat IgG(H+L) HRP (jackson )

常见的抗体公司如下:abcamEpitomicsCell signalingDakoSigmaBDR&D systemMilliporejackson

 

Sample

Ø  样本采集和保存:

尽量新鲜采集样本,及时添加裂解液裂解样本,冰上裂解,样本热变性并加入loading buffer待测,保存温度越低越好。

Ø  从组织或细胞内提取裂解物:

相对于普通裂解液,利用变性程度更强的RIPA缓冲液会更彻底和稳定的裂解组织;超声加上化学裂解能得到非常好的效果;对于组织样品,建议使用匀浆的步骤。

Ø  磷酸化蛋白检测:

使用磷酸化单去污裂解液(RIPA+磷酸酶抑制剂),降低磷酸化蛋白降解风险。

 

Product

样本制备

品名

货号

规格

价格

单去污剂裂解液RIPA

A20120A0101

50ml

RMB 120

Tris·HCl 1.0mol/LpH8.0

A20120A0202

100ml

RMB 60

磷酸化蛋白单去污剂裂解液

A20120A0102

50ml

RMB 300

cocktail蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂混合液

A20120A0102b

 

RMB 450

PMSF

A20120A0901

1g

RMB 50

还原型5X SDS上样缓冲液

A20120A0210

10ml

RMB 40

 

电泳转膜

品名

货号

规格

价格

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

A20120A0300

 

RMB 280

Tris·HCl 0.5mol/LpH6.8

A20120A0204

100ml

RMB 60

Tris·HCl 1.5mol/LpH8.8

A20120A0203

100ml

RMB 60

电泳缓冲液

A20120A0209

可配制10L

RMB 120

Western 转膜液

A20120A0208

可配制 4.8L

RMB 120

预染蛋白分子量标准(10-170kDafermantas

A20120A0803

100ul for 50

RMB 300

3MM滤纸

A20120A0604

RMB 70

NC

A20120A0603

15x20cm/

RMB 60

 

孵育曝光

品名

货号

规格

价格

DifcoTM Skim Milk 脱脂奶粉

A20120A0402

10g

RMB 40

10X丽春红染液(染膜专用)

A20120A0207

50ml

询价

beta-actin 内参抗体

A20120A0702

100ul

RMB 600

GAPDH 内参抗体

A20120A0701

100ul

RMB 600

TBST缓冲液(浓缩液)

A20120A0212

可配制2L

RMB 95

TBS缓冲液(浓缩液)

A20120A0211

可配制2L

RMB 95

Tris·HCl 1 mol/ LpH7.5

A20120A0205

100ml

RMB 60

洗脱抗体缓冲液

A20120A0213

100ml

RMB 95

 

 

Material & Methods

 

实验所用试剂:

1.      PMSFTween20、丙稀酰胺、氟化钠、过硫酸胺、甲叉双丙稀酰胺、偏矾酸钠、HClNaCl、异丙醇、DTTTEMED、β-巯基乙醇、甘氨酸、甘油、磺基水杨酸、甲醇、丽春红、三氯乙酸、溴酚蓝,国药

2.      SDSTrisSigma

3.      脱脂奶粉,Difco

4.      BSARoche

5.      ECL化学发光试剂,promage

6.      定影粉、显影粉,柯达;

 

实验相关仪器:

1.      微型离心机,GyroSpinGYROZEN

2.      电热恒温水槽,DK-420,上海精宏实验设备有限公司;

3.      电子天平,ES120D&T

4.      12孔高速微量离心机MicroSmart,北京昊诺斯科技有限公司

5.      电泳仪电源,DYY-7C,北京市六一仪器厂;

6.      电泳仪、转膜仪,DYCZ-40D,北京市六一仪器厂;

7.      X射线摄影暗匣,AX-II,广东粤华医疗器械厂有限公司;

8.      水平摇床,TS-1,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

9.      旋涡混合器,GL-88B,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;

10.   迷你水平摇床,MH-1,海门市其林贝尔仪器制造有限公司

11.   恒温金属浴,HB-100,杭州博日科技有限公司;

12.   酶标仪,DNM-9602,北京普朗新科技有限公司;

13.   离心机,TDL-80-2B,飞鸽牌;

14.   超细匀浆器,F6/10-6GFLUKO(上海)流体机械制造有限公司;

15.   移液器,10ul/200ul/1000ulDragonlab

 

实验相关耗材:

1.      1.5ml无色离心管,MCT-150-CAxygen

2.      200ul 黄吸头,T-200-YAxygen

3.      0.5-10ul 透明Gilson吸头,Axygen

4.      0.6ml无色离心管,MCT-060-CAxygen

5.      96孔酶标板,Nunc

6.      滤纸,上海实生细胞生物技术有限公司

7.      0.45um NC膜,MilliporeMillipore

8.      抗体4孔孵育槽,Nunc

 

实验步骤

第一步、样本预处理:

1)单层贴壁细胞总蛋白提取:

1.      倒掉培养基,用4℃预冷1*PBS3次,注意不要用胰酶消化,也不要把细胞吹下,冰上操作。

2.      10^6个细胞加200ul单去污剂裂解液(RIPA)(一般6孔板长满1孔细胞,每孔加200ul裂解液,覆盖整个细胞底面即可),用枪头把细胞刮下来,边刮边用移液器吸取裂解液将细胞吹下。

3.      细胞吹下后冰上放置30min裂解,用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中。

4.      收集的细胞样本-20℃冻融一次。

5.      4 12000rpm离心5min。离心完后取上清-80℃保存待用。

2)悬浮细胞总蛋白提取:

1.      将培养液直接倒入1.5ml离心管,4 1500rpm离心5min,弃上清,如果体积超过1.5ml,可将剩余培养液倒入相对应的离心管,重复离心弃上清的步骤,直到所有细胞被离心收集。

2.      4℃预冷1*PBS重悬细胞,4 1500rpm离心5min,弃上清,冰上操作。

3.      10^6个细胞加200ul单去污剂裂解液(RIPA),用移液器吹打混匀,冰上裂解30min

4.      收集的细胞样本-20℃冻融一次。

5.      4 12000rpm离心5min。离心完后取上清-80℃保存待用。

3)组织总蛋白提取:

1.      根据组织块大小,基本按照重量体积比1:5加入单去污剂裂解液(RIPA)。

2.      根据组织不同,采取的前期预处理方式不同,如肝脏这类比较块大但不粘稠的组织,可以先用剪刀剪碎,然后用电动匀浆机匀浆;眼角膜之类的比较小,不易用匀浆机匀碎,可用研磨棒研磨;脑干一类比较好处理,可直接用匀浆机匀浆;肌肉或其他粘膜或上皮组织,需要先剪碎,再用研磨棒研磨。(所有处理需在冰上操作)。

3.      冰上放置裂解30min后,用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中。

4.      4 12000rpm离心10min。离心完后取上清-80℃保存待用。

4)上样样本制备:

1.      使用BCA系统进行蛋白初定量(参照BCA蛋白定量试剂盒说明书);

2.      利用BCA蛋白定量结果,均一化所有样本总蛋白浓度,即向浓度较高样本中加入适量单去污剂裂解液(RIPA);

3.      每管样本中加入等量上样缓冲液(loading buffer);

4.      将样本放入恒温金属浴95 15mins,取出即可上样电泳,或-80℃保存待用;

注意:

1.      Western实验需要足够多的蛋白量以保证实验结果的质量,样本量需细胞多于10^6个,组织湿重大于50mg,匀浆液体积大于100ul且总蛋白浓度大于0.5mg/ml

2.      高脂肪或糖类组织,组织匀浆或液氮研磨後须4 12000rpm 10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;

3.      Western的蛋白样本制备后,越早进行实验,效果越好,保存时间过长会增加蛋白降解风险;

4.      磷酸化蛋白有丰度低、易降解的特点,做Western实验必须在RIPA中预先加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂,以保证实验质量。

 

第二步、电泳制膜:

1.      按目的蛋白大小制取1.0mm分离、浓缩胶,分离胶的配制:10%

2.      将胶浸没于电泳缓冲液中,向泳道中注入10μg 预处理蛋白样本;

3.      浓缩胶电泳条件80V 30mins,分离胶电泳条件120V 60mins

4.      将电泳得到的带有蛋白的分离胶按以下顺序叠放:海绵垫、3层滤纸、分离胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫,将胶朝向负极、转膜装置浸没于转膜缓冲液中;

5.      小分子蛋白(小于90kDa)转膜条件为4 60V 1.5h,大分子蛋白 (大于90kDa)转膜条件为4 120V 2h

6.      转膜后,将转膜制得的承载膜先置于TBST中浸润,在丽春红中染色,验证转膜成功后用TBST将丽春红洗脱,进入孵育步骤;

注意:

1.      本实验中使用的承载膜为硝酸纤维素(NC)膜,转膜方式为湿转。

2.      如需测的蛋白分子量大小差距较大,可将膜根据marker剪开,孵育不同的抗体。

3.      在上样时,为了保证电泳质量,最两边的泳道以及未上样的泳道会上有loading buffer保护。

来自"http://www.transhold.org/wiki/RT-PCR_%E4%B8%A4%E6%AD%A5%E6%B3%95%E7%9A%84CDNA%E5%90%88%E6%88%90%E5%B8%B8%E7%94%A8%E8%AF%95%E5%89%82%E4%BD%BF%E7%94%A8%E8%AF%B4%E6%98%8E%E2%80%94%E2%80%94promega_MMLV"

 

第三步、封闭孵育曝光、抗体洗脱;

1.      将载有蛋白的承载膜整张浸没于5%脱脂牛奶中,室温摇晃1h

2.      TBST稀释一抗,将膜浸没于稀释过的一抗工作液(总体积为2ml)中,4℃孵育过夜或者室温孵育1.5h

3.      TBST在摇床上室温清洗已经孵育好一抗的膜,10min*3次。

4.      TBST稀释二抗,将膜浸没于稀释过的二抗工作液(总体积为2ml)中,室温孵育1 h

5.      TBST在摇床上室温清洗已经孵育好二抗的膜,10min*3次。

6.      将膜从TBST中取出,放在平整的位置,向膜上滴加ECL发光液,将膜移至曝光袋中(防止ECL直接接触X光片)。

7.      在暗室中,将曝光袋放入X射线摄影暗匣内,再放上合适大小的X光片,关上曝光匣开始曝光。曝光结束后,取出X光片,在显影液中浸泡3分钟,稍加沥干,置于定影液中放置3分钟。将曝光完成的X光片在水下冲洗,至无定影液残留,此时X光片上相应位置的黑色条带即为最终结果。

8.      经过抗体孵育、曝光后的膜可用抗体洗脱液洗脱抗体。将膜放入抗体洗脱液,在50℃水浴中,手动搅拌5分钟,静置10分钟,重复3次。

9.      抗体洗脱后的膜需从封闭重新开始,孵育一抗、二抗、曝光。

注意:

1.      实验中本公司提供内参β-actinGPADH一抗以及抗兔、小鼠、山羊二抗抗体,目的蛋白抗体或特殊种属二抗由客户提供。

2.      WB最终实验结果与一抗质量及样本有密切关系,实验中技术员会根据曝光结果调整一抗稀释比及上样量,如最终结果不佳是由客户提供的一抗质量或样本较差所致,本公司概不负责。

3.      实验中的一般曝光条件为1min5mins1h,取效果最佳的一张;根据曝光的结果,此条件可适当调整。

4.      抗体洗脱为正常实验步骤,可能会洗去部分蛋白,但在多数情况下并不影响实验结果,但不建议多次反复进行抗体洗脱,以免影响后续实验质量。

5.      TBST洗膜的步骤可根据具体情况适当调整洗膜时间与次数。

 

Discussion

 

一、预处理前的准备工作:

蛋白酶非常稳定,是导致蛋白降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使蛋白酶完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与蛋白制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。

蛋白酶的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。

处理样本时尽可能使用无菌,一次性塑料制品,如果没有开封使用过,通常没有必要再次处理。

二、电泳制膜说明:

将处理过的样本蛋白在PAGE胶中电泳,通过分离胶的分子筛作用得到不同分子量大小的蛋白,并将电泳得到的蛋白原位转移至承载膜上。

三、封闭孵育曝光、抗体洗脱说明:

5%脱脂牛奶将承载膜上多余的蛋白承载位点封闭,浸润于稀释过的一抗中,通过抗体和抗原的特异性结合,使一抗与样本蛋白中的相应抗原结合,洗去多余一抗,再将膜浸润与稀释过的二抗中,使二抗(含有HRP)与一抗(此时为抗原)结合,洗去多余二抗,在膜上滴加适量ECL发光液,ECL发光液在HRP的作用下发出荧光,可被X光片吸收成像。曝光成像后X光片上的相应位置的黑色条带即为最后结果。在一个蛋白完成后,可通过抗体洗脱液将结合在蛋白上的一抗、二抗洗去,再次孵育一个抗体。

四、数据分析部分:

最后曝光所得的X光片会经过扫描机扫描,由技术员截图,并经过图像软件得到去除背景的灰度图像,由电脑计算目的条带的阴影面积得到数值,并由技术员做出数据报告。

 

1.检查仪器及试剂

    检查各仪器是否完好可用,各试剂是否在使用期限内,各耗材是否准备充分。

 

 

2. 样本前处理及蛋白定量

   将保存好的样本(注意避免反复冻融)取出,用剪刀和镊子将其剪成实验所需大小,置于离心管中,在管壁上标识样本名称,注意取不同样本时的取样工具要在PBS中清洗,避免交叉污染,在天平上称量样品重量,记录,根据所称重量加入5倍体积的单去污裂解液,用电动匀浆机进行匀浆,在匀浆不同样本时要在PBS中清洗,避免交叉污染,匀浆后在离心机中12000转离心15分钟,取上清液测定蛋白浓度,(注意要尽快测蛋白浓度防止降解),测定用BCA试剂盒,做法依说明书所示。


3. 蛋白变性

将测好蛋白浓度的样本进行均一化处理,按照测量蛋白浓度的结果,以样本中最小蛋白含量为参照值,拉平所有样本蛋白浓度,计算在16ul体系下需要加的样本和补足的缓冲液的体积数,(若需要多次试验则准备160ul体系的各体积数),置于90℃金属浴中15分钟。变性结束后,及时保存好样本,供后续试验使用。


4. 电泳

   4.1配胶

      将配胶用的玻璃板置于有洗涤剂的清水中(每周一换)用棉条轻轻擦拭(不可用布,防止划伤玻璃),洗好后用清水冲干净,标准是在玻璃板面上有凝聚的水珠而非大滩的水渍,在操作台上铺一层纸巾,将两块玻璃板放在纸巾上,互相结合面朝上,用吹风机吹干板上水珠,若有残留,用纸巾将水珠点干,避免大面积擦拭划伤玻璃。

       手持已经干燥的玻璃板,注意手持玻璃板边缘,将其重合好后,置于制胶器中,用楔子固定,注意观察两玻璃底面与制胶器底部是否水平,缝合良好,将做好的制胶器置于制胶架上,(制胶架擦拭干净),固定时将两侧的固定轴同时往里挤压,然后双手同时顺时针转动至所需标的角度上(1.0mm的胶转至1.0mm刻度以此类推),听到双手转至咔的一声,固定结束。

       配置分离胶,按照试剂配置表,准备好相应的试剂,注意试剂的保存条件,配胶时要迅速,防止时间过长凝胶,若温度过低导致试剂沉淀,凝结,则需在37℃水浴中将其混合均匀,配好后,用900ul的枪在一面玻璃板上加5枪,注意加的时候要缓慢加,避免漏胶,避免混入气泡,然后用枪在板面各处滴加水滴压胶,至与板面水平,制好后等待20分钟以便凝胶,若温度过低,需要置于室温20℃环境中凝胶,或者延长凝胶时间。

       将板面的水层倾倒,用滤纸吸干残留的水滴,注意不要和分离胶接触,以免发生粘连。配置浓缩胶要求同上,在配好后迅速插入上样梳,注意插好后不要太用力,等待凝胶时间和温度过低时处理方式亦同上。凝胶后一定要在制胶槽中充入电泳液再拔梳子,否则拔得时候上样孔会扭曲,拔梳子时,双手同时捏住梳子的两端,同时轻轻往上拔,用力要均匀一致,避免产生气泡,若拔的过程中,凝胶不好,可能是由于配浓缩胶所用AP或TEMD不准,需要重配,这一步一定很谨慎,否则做不好会导致重来浪费时间,后续的操作都要依次后推。

 

  4.2上样 

      事先将每块胶的泳道上样的排版排好,一般一块胶上8个样本,不同客户的样本用loading隔开,若排不满15个泳道,其余空的泳道用loading隔开,一般样本上16ul体系,loading上4ul,marker上3ul体系,加样的时候,枪头注意不要插入上样槽很深,注意加样不要溢出。若上4块胶或更多时,要注意一定要等所有的胶全部制好才能上样,否则溴酚蓝在缓冲液中时间过长会导致溢出。

电泳,在电泳槽中充满电泳缓冲液,电泳液不要过满,注意接头处要保持干燥避免短路,电泳仪调至80v跑30-45分钟,待在浓缩胶中将蛋白拉到同一水平线上,转到120v,共跑一个半小时。注意要把marker分子量最小的蛋白跑出来。有的电泳中蛋白阻力比较大,一个半小时可能还没有把分子量最小的蛋白跑出来,要延长电泳时间,直到跑出。


5. 转膜

      准备一个水槽,充入转膜缓冲液,将电泳结束后的电泳装置拆开,把玻璃板取出在清水下冲一下,双手抵住玻璃板将结合部位撬开,注意一定要动作柔和,防止胶碎,用小铲子将胶和玻璃贴合面轻轻划痕,把浓缩胶的部分弃掉,分离胶的部分用铲子轻轻铲出放在有转膜缓冲液的水槽中,取三张滤纸重叠好,浸入转膜缓冲液,取一张转膜的nc膜,注意用镊子取夹,避免接触到nc膜表面,浸入转膜缓冲液中,将胶按照上样的顺序平置于掌心中,上面垫一层nc膜,注意覆盖完全,再在上面一层垫三层滤纸,取一层浸了转膜缓冲液的棉垫,在胶的下层同样放置浸了转膜缓冲液的滤纸和棉垫,将“整个三明治 ”放在水槽中,用铲子水平赶走气泡,注意要记住胶在上面还是膜在上面,将胶的一面放在转膜夹的黑色一面,插好后充入转膜缓冲液,转膜电压60v,在4℃下转膜一个半小时。


6. 染膜

      将转膜结束的装置拆开,用镊子取出nc膜,放入TBST中,其余棉垫清洗后回收使用,滤纸以及胶弃掉,胶有毒注意妥善处理。按照丽春红溶液:双蒸水1:10配置染膜溶液,混匀。用镊子夹取nc膜放入染膜溶液中浸没,三分钟后放入清水中清洗,观察染膜结果,目的蛋白是否在准确的位置上。用剪刀剪下目的蛋白区域的膜,注意要用镊子避免接触到蛋白,剪膜的时候注意避免接触到目的蛋白,在膜的边缘无蛋白区标识可识别的标志。


7. 封闭

  脱脂牛奶0.5g,加到TBST 50ml中,现配现用,将剪好的nc膜放在封闭液中,注意不要将膜层叠在一起,在脱色摇床上以一定的速率进行封闭一个小时。


8. 一抗

      将一抗按照说明书上的稀释比进行稀释,若预实验效果不好,进行梯度稀释,注意样本和抗体的种属是否匹配,注意抗体不要长时间置于外面,用完后及时将其放入冰箱中,将抗体从冰箱中取出,进行混匀离心,计算样本所需要的抗体量,用TBST进行稀释,稀释混匀注意不要用加样枪吹打避免产生气泡,抗体稀释液一般加2ml,将nc膜用镊子将有蛋白的一面孵到抗体稀释液中,放入4℃冰箱中过夜。

 

9. 洗脱

  将孵育好的nc膜从孔槽中取出,放入装有TBST的平皿中,脱色摇床以固定转速清洗10分钟,三次。注意膜不要层叠在一起。


10. 二抗

      将二抗从冰箱中取出,混匀离心,计算样本所需要抗体量。用TBST稀释,注意若按照稀释比,抗体的量少于1ul,则要按照至少1ul的量来计算所需的TBST的量,放入孔槽中孵育一个小时。因大多数样本的二抗是固定几种,因此计算中总的二抗需用量,在离心管中进行稀释,稀释时注意不要用加样枪进行吹打,避免产生气泡。


11. 洗脱

  将孵育好的nc膜从孔槽中取出,放入装有TBST的平皿中,脱色摇床以固定转速清洗10分钟,三次。注意膜不要层叠在一起。

 

12. ECL显色

   将显色液从冰箱拿出,注意避光,将A液,B液按照等体积混合,一般一张膜用量1ml,用枪均匀滴在膜表面,剪开一个自封袋,用镊子把膜平整放在自封袋中,压好,避免产生气泡,放在光片夹中。


13. 曝光

      将装有nc膜的光片夹拿到暗室中,避免有任何的光源,在暗室灯中剪裁大小合适的胶片,层叠三张于nc膜上,压好,关上光片夹,计时20分钟,曝光后,在暗室将光片夹打开,放入显影液中静置3分钟后,放入定影液中清洗,此时曝光结束,出暗室,在清水下冲洗胶片。


14. 数据分析处理

     将曝光好的胶片进行分析,对比marker,观察目的蛋白条带是否出现,背景是否干净,条带差异是否真实符合逻辑,观察内参条带是否均一,在预实验中摸清抗体的准确稀释比,样本是否可用,根据预实验得出的结论,安排下一步的正式试验,试验情况良好,用扫描仪扫描胶片,根据内参条带,计算灰度值,确定样本组间灰度值的差异。


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