一、背景：
MicroRNAs（microRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的microRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。成熟的microRNA 的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为pri-microRNA的初级转录物；动物pri-microRNA的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为70个核苷酸左右并能形成茎-环结构的microRNA 前体，称为pre-microRNA；第二次剪切位于细胞质中，pre-microRNA被剪切成21-25个核苷酸成熟的microRNA。
MicroRNA 自从1993年首次被报道以来，现已经被发现了3000多种，存在于人类和所有的模式生物中。MicroRNA 通过与mRNA的3’
UTR 结合而介导翻译水平的调控，也可通过与mRNA结合的互补程度决定microRNA将以何种机制发生作用；完全的互补引起与RNAi类似的作用，不完全互补则导致翻译抑制作用。因此，研究microRNA对于深入探讨生命现象的本质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义；对于疾病的诊断、治疗和预防具有潜在的实际应用价值。
关于microRNA:
图１，pre-microRNA 和 microRNA 示意图
二、BioTNT microRNA
qPCR(茎环法)引物试剂盒
microRNA由于长度太短，一般难以检测。 BioTNT 研发 microRNA qPCR Detection System ， 是专门用于microRNA 定量检测的系统。
该microRNA检测试剂盒microRNA qRT-PCR Detection
Kit包括:
1.应用于microRNA的特异茎环逆转录系统、及其qPCR 反应特异microRNA的引物assay;
2.特异性的茎环逆转录引物和qPCR检测上下游引物;
3.专门的PCR 荧光定量检测系统;
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优势：
1. 应用茎环逆转录引物进行逆转录，可以区分成熟的microRNA和Pre
microRNA；
2. 应用BioTNT microRNA qRT-PCR
sybgreen Detection Kit，已经优化的适合特异茎环逆转录引物进行CDNA合成的protocol，用于120个microRNA样本的已知第一链CDNA合成；
3. BioTNT 经验证的特异性茎环系统assay 可以提供您最方便的实验方案；采用了120Tests的包装，方便您的实验；
特征：
本方法可以采用经典的trizol法抽提得到的总RNA；
检测的特异性：独特的microRNA茎环逆转录引物的设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-microRNA的污染；
检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的microRNA；
一站式解决方案：BioTNT不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性microRNA
assay；
检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的microRNA；
说明
1.BioTNT microRNA qRT-PCR sybgreen
Detection Kit已包含有检测所需要的所有试剂, 客户仅需要提供RNA及BioTNT 特异性茎环系统assay即可进行microRNA检测；
2.我们提供的BioTNT 特异性茎环系统assay建议同BioTNT
microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用；
3.我们承诺推出的每个BioTNT 特异性茎环系统assay都提供利用BioTNT
microRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit进行验证的报告，其报告内容包括验证流程、引物相应扩增曲线、融解曲线、及其推荐的反应条件, 同时还提供阳性的cDNA验证模板，客户可以参考此条件进行检测实验。
二、BioTNT microRNA qPCR(加尾法)检测试剂盒：
示意图：
MicroRNA由于长度太短，一般难以检测。
BioTNT采用在microRNA的 3’末端通过Poly(A)Polymerase，使得microRNA 添加了polyA 尾, 再采用特别设计的biotnt
oligo(dt)- 通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成microRNA对应的cDNA第一链，从而完成了microRNA的逆转录反应 。
microRNA逆转录试剂盒（加尾法）包含microRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂,该试剂盒具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率,可从20pg-1ug的总RNA中有效制备microRNA对应的cDNA第一链。
注:该试剂盒须与BioTNT microRNA荧光定量检测试剂盒(A2030A202)配套使用。
说明
该试剂盒中包含microRNA荧光定量检测的所有试剂，包括2×microRNA
premix和Reverse primer set。2×microRNA premix是专门为microRNA检测而研发的新一代荧光定量检测试剂， 该检测试剂采用premix预混系统，包含了优化配比的dNTP、增强剂、稳定剂等，且其中的DNA
polymerase采用的是新一代化学修饰法的热启动技术，保证高特异性和高灵敏度。
NOTE：加尾法的实验的难点在于，同样的一条QPCR 下游引物，与多达上千种的microRNA 设计出来的上游引物一起配对，会存在以下困难：
1. TM 值适配的困难；高GC 或者低GC的microRNA 很难设计或者修饰上游引物；
2. 引物二聚体：同一条下游引物必然会与某些上游引物形成比较强的二聚体；
BioTNT 独创加尾法Reverse
primer set，为了让您的加尾法QPCR进行得更顺利 ，Biotnt microRNA荧光定量检测试剂盒（加尾法）试剂盒中包括一系列的下游引物（退火温度覆盖10度），方便您优化整体的QPCR实验。
这套加尾法QPCR Reverse
primer set 为您提供了较高的上游引物设计灵活度，您的上游引物设计TM 值可以从58度到69度的范围，都能找到适配的下游引物。同时，不同的下游引物与您设计的上游引物进行配对，您可以通过预实验验证，寻找更合适的上游引物和下游引物，适配率高达95%以上。
产品特点：
通量高：可用于从一个合成反应的cDNA中检测多种microRNAs。
特异性：性能优良的化学热启动PCR聚合酶技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增。
保存条件： -20℃避光保存。
适用范围：
对microRNA反转录后的cDNA进行荧光定量PCR检测；
适用于各种类型荧光定量PCR仪
备注：
请与microRNA逆转录试剂盒（加尾法）A2030A201配套使用以达到最佳效果，若使用其它反转录试剂盒获得的cDNA进行检测，请咨询BioTNT客服。
四、microRNA 加尾法引物（验证）引物；
MicroRNAs（microRNAs）是一类由18～25核苷酸组成的非编码单链小分子RNA，具有表达的时序性、序列严格的保守性、组织器官表达量的相对特异性等特点，在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用。
目前microRNA相关研究在迅速增减，为了方便客户，我们推出了microRNA加尾法验证引物。
验证样本microRNA mimics，经过BioTNT microRNA逆转录试剂盒（加尾法）A2030A201合成cDNA后，配合microRNA荧光定量检测试剂盒（加尾法）A2030A202及试剂盒中的下游引物set进行荧光定量验证。BioTNT 为您提供经设计并验证的可用于加尾法实验的引物，包括上游引物（实物），以及提供您最优的下游引物编号，方便您进行整体microRNA
QPCR 实验。订购货号为：CUS-PA-microRNA名称。
所有引物规格均为 500次×20ul qPCR体系
成品均为液体状态10× 统一价格 240元/套
BioTNT microRNA QPCR 实验相关产品订购指南：
一、RNA 抽提：
经验证，可以使用以下产品进行样品RNA 抽提， RNA抽提质量符合QPCR
Array实验样本质量要求：
请根据您的样本选择抽提试剂盒；无论您是否采用bioTNT 提供的抽提试剂盒，建议您在进行逆转录和QPCR实验前进行RNA 和CDNA 样品质量验证；验证方式见附录；
二、逆转录和QPCR实验：
BioTNT 针对microRNA的特点，开发了两类试剂盒，一类为特异性茎环法microRNA 检测试剂盒，一类为加尾法microRNA 检测试剂盒
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特异性茎环法microRNA 检测
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加尾法microRNA 检测
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原理
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采用特异性茎环法逆转录，一份样本一次仅转录出一种microRNA
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采用polyA 加尾进行逆转录，一份样本一次转录德所有microRNA
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适用
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microRNA 检测，分子数量少于20个，含量中低的分子
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microRNA 检测，可以进行初筛
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是否可用于PCR Array
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不可
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可
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灵敏度
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灵敏度高
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灵敏度中等，中强表达基因可检测，弱基因比较难
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特异性
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特异性高
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特异性中等
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是否可以检测多基因
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一份RNA （20ul，1ug/ul）可以检测约20个microRNA
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一份RNA （20ul，1ug/ul）可以检测超过100个microRNA
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操作
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一次逆转录仅一种microRNA, 多分子操作比较繁琐
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一次逆转录多种microRNA
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根据您的样本数量，和检测的分子数量，您可以选择茎环法或者加尾法；
您也可以选择加尾法先进行初筛，含量比较低的再用茎环法进行检测。
三． 茎环法特异性逆转录和QPCR 试剂盒：
根据您的样本数量，您可以购买以下组合：
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品名
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货号
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产品分类
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品牌
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规格
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microRNA 茎环QPCR试剂盒
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根据指标查询
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microRNA
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BioTNT
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120T
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microRNA 特异性茎环引物试剂盒
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根据指标查询
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microRNA
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BioTNT
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120T
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microRNA 内参茎环引物试剂盒
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根据指标查询
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microRNA
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BioTNT
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120T
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举例：
其中，1个microRNA 茎环QPCR试剂盒包括120T逆转录试剂盒，一个目的microRNA 引物试剂盒（含茎环逆转录引物+QPCR 上游引物+QPCR 下游引物），附送1个内参microRNA引物试剂盒，10ul*400T
QPCR premix。
如果您要检测30份样本，2个microRNA，1个内参，您可以这样购买： 1个 microRNA 完整试剂盒+1个microRNA 引物试剂盒；
您也可以分开购买：
根据您的样品数量，选择试剂盒的规格；可以在RNA 验证合格后先小批量逆转录样本，并进行样本质量验证；质量合格后进行QPCR实验；
附件：
样品质量验证：
为了保证microRNA QPCR实验的质量，建议在使用前先进行样本质量验证；
RNA 定量与质量控制
A.使用无菌水(RNase-free)稀释 RNA 样本，检测 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 应大于 1.8。
B.使用公式A260× 40 ×稀释倍数 = XXXXμg/mL 计算 RNA 浓度。
C.使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
D.建议：RNA质量测定后，逆转录得到cDNA，建议用多个内参基因自行验证cDNA质量；
推荐购买BioTNT的 microRNA 内参引物试剂盒；进行样本CDNA 质量验证；
推荐：
RNU6B microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
RNU6 microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
RNU48 microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
Rnu6B microRNA mouse 内参real time PCR 检测试剂盒
snoRNA202 microRNA mouse 内参real time PCR检测试剂盒
Rnu6B microRNA rat 内参real time PCR 检测试剂盒
U87 microRNA rat 内参real time PCR检测试剂盒
如果是血清中的microRNA， 建议使用microRNA 16作为内参。
三、加尾法microRNA 检测试剂盒
：
BioTNT 为您提供QPCR 相关的所有试剂：
举例：如果您有20个样本，5个目的microRNA, 1个内参，双重复实验，您可以购买1个microRNA逆转录试剂盒（加尾法），25T ，1个microRNA荧光定量检测试剂盒（加尾法），500T；以及5个microRNA 加尾法验证引物。
附件：
样品质量验证：
为了保证microRNA QPCR实验的质量，建议在使用前先进行样本质量验证；
RNA 定量与质量控制
A.使用无菌水(RNase-free)稀释 RNA 样本，检测 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 应大于 1.8。
B.使用公式A260× 40 ×稀释倍数 = XXXXμg/mL 计算 RNA 浓度。
C.使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。
D.建议：RNA质量测定后，逆转录得到cDNA，建议用多个内参基因自行验证cDNA质量；
推荐购买BioTNT的 microRNA 内参引物试剂盒；进行样本CDNA 质量验证；
推荐：
RNU6B microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
RNU6 microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
RNU48 microRNA human 内参real time PCR检测试剂盒
Rnu6B microRNA mouse 内参real time PCR 检测试剂盒
snoRNA202 microRNA mouse 内参real time PCR检测试剂盒
Rnu6B microRNA rat 内参real time PCR 检测试剂盒
U87 microRNA rat
如果是血清中的microRNA， 建议使用microRNA 16作为内参。
BioTNT 五年QPCR microRNA QPCR 检测倾情服务！ 优质服务品质回报社会！
BioTNT 生物技术服务部自从2005年成立以来，承接了超过200个QPCR microRNA 技术服务项目，积累了广泛的QPCR 定量检测的经验。
一、简介： 关于microRNA
MicroRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。成熟的microRNA 的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为pri-microRNA 的初级转录物；动物pri-microRNA的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为70个核苷酸左右并能形成茎-环结构的microRNA 前体，称为pre-microRNA；第二次剪切位于细胞质中，pre-microRNA被剪切成21-25个核苷酸成熟的microRNA。
MicroRNA 自从1993年首次被报道以来，现已经被发现了3000多种，存在于人类和所有的模式生物中。MicroRNA 通过与mRNA的3’ UTR 结合而介导翻译水平的调控，也可通过与mRNA结合的互补程度决定microRNA将以何种机制发生作用；完全的互补引起与RNAi类似的作用，不完全互补则导致翻译抑制作用。因此，研究microRNA对于深入探讨生命现象的本质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义；对于疾病的诊断、治疗和预防具有潜在的实际应用价值。
关于microRNA：
图１，pre-microRNA 和 microRNA 示意图
MicroRNA由于长度太短，一般难以检测。
二、BioTNT miRNA qPCR Detection System 介绍
BioTNT 生物技术部推出了 miRNA qPCR Detection System ， 是专门用于miRNA 定量检测的系统。该系统包括：
· miRNA检测试剂盒miRNA qRT-PCR Detection Kit:
- 应用于miRNA的特异茎环逆转录系统、及其qPCR 反应特异miRNA的引物assay：
- 特异性的茎环逆转录引物和qPCR检测上下游引物。
.JPG)
特点：
-
1. 应用茎环逆转录引物进行逆转录，可以区分成熟的microRNA和premicroRNA；
2. 应用BioTNT miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit，已经优化的适合特异茎环逆转录引物进行CDNA 合成的protocol，用于100个microRNA样本的已知第一链CDNA合成；
3. BioTNT 经验证的特异性茎环系统assay 可以提供您最方便的实验方案；采用了100Tests的包装，方便您的实验；
产品特征：
² 本方法可以采用经典的trizol法抽提得到的总RNA；
² 检测的特异性：独特的miRNA茎环逆转录引物的设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染；
² 检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA；
² 一站式解决方案：BioTNT不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性microRNA assay；
² 检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA；
质量说明
- BioTNT miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit已包含有检测所需要的所有试剂, 客户仅需要提供RNA及BioTNT 特异性茎环系统assay即可进行miRNA检测；
- 我们提供的BioTNT 特异性茎环系统assay建议同BioTNT miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用；
- 我们承诺推出的每个BioTNT 特异性茎环系统assay都提供利用BioTNT miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit进行验证的报告，其报告内容包括验证流程、引物相应扩增曲线、融解曲线、及其推荐的反应条件, 同时还提供阳性的cDNA验证模板，客户可以参考此条件进行检测实验。
三、BioTNT QPCR microRNA 样本准备
3.1 组织样本准备
注意：BioTNT QPCR microRNA 检测的样本取样同Real time PCR的组织取样与保存：
1、 取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；
5、 速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
BioTNT QPCR microRNA 的细胞取样与保存
1、 悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
样本运输：干冰运输
3.3 血清/血浆样本准备：
建议采用血浆样本，可以得到相对更好的实验结果。
使用抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：1000g离心10分钟，分离血浆和细胞组分。（注意：血浆收集应使用抗凝管，抗凝剂可以用柠檬酸钠或EDTA等，但一定不要使用肝素抗凝，因为肝素对后续实验有较大影响。）将采集好的血浆转移至单独的冻存管，按照每400-500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。
3.4 全血样本准备：
请按照实际使用的收集方法，如注射器收集或真空收集管等，参考相应的厂商提供产品说明进行操作。
采集好全血，将采集好的全血转移至单独的冻存管，按照每500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。
3.5 石蜡样本准备：
石蜡切片，至少三片；或者提供石蜡块，常温保存。
四、BioTNT QPCR microRNA 检测使用的仪器
进行检测使用的主要仪器为QPCR， BioTNT 使用life technology最新款的ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统进行microRNA的QPCR 检测。
ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统在单一的高性能仪器上融合了您需要的所有实时荧光定量PCR特性，从而帮助您优化研究效率。ViiA™7系统具有简单的工作流程、直观的软件、触控屏界面以及使误操作降至最少的单键实验方案，可提供出众的重复性和最小的孔间和仪器间差异。
产率
ViiA™ 7系统适用于中等至高通量实时荧光定量PCR，可提升您的实验室效率。
快速的加热块更换——前开门设计使热循环加热模块的更换变得更容易，无需移动旁边的设备，如机械臂或计算机
简单的触摸屏界面——仪器触摸屏提供了一键式实验方案，可快速简单地完成各种应用Assay的设置
自动化兼容性——ViiA™ 7系统结合了Applied Biosystems® Twister® II 机器人，使您在自动化环境下实现效率最大化
整合
可与TaqMan® Array微流体芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容：实时荧光定量PCR分析的金标准，具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。
384 孔通量且无需机器辅助——采用TaqMan® Array微流体芯片，无需移液机器人或复杂的移液装置；只需加入您的样本和预混液，即可在ViiA™ 7系统上运行
与全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系统已经过优化，可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白质、非编码 RNA 和Pri-miRNA Assay)，从而获得清晰简洁的数据
性能
ViiA™ 7系统具有下列特点：
OptiFlex® 系统——增强型荧光检测，可实现准确且灵敏的数据分析
最大程度的多重分析能力——6 个可自由组合的激发和发射滤光片通道，可实现最多的染料组合和最大的多重反应能力
灵活的数据采集——多种升降温方法检测形式为升降温阶段的荧光数据采集提供了更多的灵活性
精确定量——在单色反应中可检测出低至1.5倍的拷贝数差异
ViiA™ 7软件具有：
直观的界面和创新的设计
便捷的自动化操作
更强大的数据分析
与高通量完全兼容
可扩展的软件构架
提供可选的附加性能，可升级至现有软件。
遵循美国联邦法规第21章第11节(21 CFR Part 11)——可选的SAE模块，提供记录安全、审计和电子签名信息，从而实现全方位的数据可追溯性
高分辨率熔解曲线(HRM)——采用内置的MeltDoctor™ 实验方案和校准，您可以缩短优化运行的时间，从而将更多的时间用于分析您的结果。通过方便的软件设置即可根据需要设置基因型种类的数目。
仪器图片：
五、BioTNT QPCR microRNA 检测标准服务流程
BioTNT microRNA 检测技术服务标准流程：
1、 客户提供样本（组织，细胞或者RNA)，请参照取样与保存；
2、 客户提供检测指标；
3、与客户协商内参的选取（人，大鼠，小鼠均有两种内参可以采用）；
4、采用 BioTNT PCRmiRNA qPCR Detection System ；
5、客户样本验证进行抽提，特异性逆转录，QPCR 检测，验证系统是否好用；
6、 客户的大批量样本进行处理，抽提和实验。
实验对象为组织样品，组织量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，细胞数量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
组织块少或者细胞量小的时候，采用Qiagen 柱式抽提（RNeasy Micro Kit（50） 74004 ）。费用为120元/个；
血液样本，如血浆或者血清，采用Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）217184 ，费用为140元/个；
石蜡样本，采用miRNeasy FFPE kit（50）217504，费用为160元/个；
7、 RNA 特异性逆转录得到内参CDNA， 对样本的质量进行验证；
8、 大批量样本real time PCR实验；使用仪器为：ABI 公司的Vii7；
9、 靶基因表达水平结果分析，数据分析方法为：delta delta CT 法；也可以采用相对定量的标准曲线法；
10、 提供客户实验报告；包括方法，材料，设备，原始数据和计算数据的成套材料；
六、BioTNT real time PCR 检测技术服务收费标准
☆ 实验步骤
组织或细胞总RNA抽提 80元(trizol抽提microRNA，一个组织或细胞标本)；
离心柱式抽提费用细胞/组织 120元/样；
血清/血浆 140元/样；
石蜡切片 160元/样
特异性逆转录+目的基因实时定量PCR 数据分析 双重复数据120元(一个标本一个指标)，三重复数据160元 （内参同样按照目的基因收费）
引物等费用涵盖在这里面；
如需制备标准曲线，收取标准曲线制备费用200元/一个基因
一次取样，超过3个，免费；小于等于3个样品， 上海市区收取20元/次的取样费用；上海郊区，不上门取样；
外地邮寄费用自理；
☆ 全套技术服务
您只需提供组织或细胞标本，我们为您完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
【您只需提供】
◇ 组织
◇ 或，高浓度的Total RNA
◇microRNA 名称
【我们向您提供】
◇ 实验材料、仪器、方法、步骤
◇ 供发表的引物序列、扩增曲线、熔解曲线
◇ 原始实验数据和计算好的正式实验数据
◇ 免费实验培训、技术支持
BioTNT 五年QPCR microRNA
QPCR 检测倾情服务！ 优质服务品质回报社会！
BioTNT 推出microRNA 加尾法检测试剂盒和相关技术服务！适用于microRNA 多基因检测/PCR
Array
BioTNT 生物技术服务部自从2005年成立以来，承接了超过200个QPCR microRNA 技术服务项目，积累了广泛的QPCR 定量检测的经验。
一、简介： 关于microRNA
MicroRNAs（microRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的microRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。成熟的microRNA
的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为pri-microRNA 的初级转录物；动物pri-microRNA的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为70个核苷酸左右并能形成茎-环结构的microRNA
前体，称为pre-microRNA；第二次剪切位于细胞质中，pre-microRNA被剪切成21-25个核苷酸成熟的microRNA。
MicroRNA 自从1993年首次被报道以来，现已经被发现了3000多种，存在于人类和所有的模式生物中。MicroRNA
通过与mRNA的3’ UTR 结合而介导翻译水平的调控，也可通过与mRNA结合的互补程度决定microRNA将以何种机制发生作用；完全的互补引起与RNAi类似的作用，不完全互补则导致翻译抑制作用。因此，研究microRNA对于深入探讨生命现象的本质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义；对于疾病的诊断、治疗和预防具有潜在的实际应用价值。
关于microRNA：
图１，pre-microRNA 和 microRNA 示意图 MicroRNA由于长度太短，一般难以检测。
二、microRNA 检测路线的选择：
BioTNT 针对microRNA的特点，开发了两类试剂盒，一类为特异性茎环法microRNA 检测试剂盒，一类为加尾法microRNA 检测试剂盒
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特异性茎环法microRNA 检测
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加尾法microRNA 检测
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原理
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采用特异性茎环法逆转录，一份样本一次仅转录出一种microRNA
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采用polyA 加尾进行逆转录，一份样本一次转录德所有microRNA
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适用
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microRNA 检测，分子数量少于20个，含量中低的分子
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microRNA 检测，可以进行初筛
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是否可用于PCR Array
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不可
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可
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灵敏度
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灵敏度高
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灵敏度中等，中强表达基因可检测，弱基因比较难
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特异性
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特异性高
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特异性中等
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是否可以检测多基因
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一份RNA （20ul，1ug/ul）可以检测约20个microRNA
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一份RNA （20ul，1ug/ul）可以检测超过100个microRNA
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操作
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一次逆转录仅一种microRNA, 多分子操作比较繁琐
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一次逆转录多种microRNA
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根据您的样本数量，和检测的分子数量，您可以选择茎环法或者加尾法；
也可以选择加尾法先进行初筛，含量比较低的再用茎环法进行检测。
BioTNT microRNA 加尾法qPCR Detection System 介绍示意图：
二、BioTNT 推出microRNA 加尾法检测试剂盒：
示意图：
MicroRNA由于长度太短，一般难以检测。
BioTNT采用在microRNA的 3’末端通过Poly(A)Polymerase，使得microRNA 添加了polyA 尾, 再采用特别设计的biotnt
oligo(dt)- 通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成microRNA对应的cDNA第一链，从而完成了microRNA的逆转录反应 。
microRNA逆转录试剂盒（加尾法）包含microRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂,该试剂盒具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率,可从20pg-1ug的总RNA中有效制备microRNA对应的cDNA第一链。
注:该试剂盒须与BioTNT microRNA荧光定量检测试剂盒(A2030A202)配套使用。
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品名
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货号
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产品分类
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品牌
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规格
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microRNA逆转录试剂盒（加尾法）
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A2030A201
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microRNA
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BioTNT
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25T
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microRNA逆转录试剂盒（加尾法）
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A2030A201X2
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microRNA
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BioTNT
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50T
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microRNA荧光定量检测试剂盒（加尾法）
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A2030A202
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microRNA
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BioTNT
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100T
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microRNA荧光定量检测试剂盒（加尾法）
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A2030A202X5
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microRNA
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BioTNT
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500T
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microRNA 加尾法引物(验证）
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CUS-PA-microRNA名称
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microRNA
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BioTNT
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500T
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microRNA逆转录试剂盒（加尾法）
10*RT Primer
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A2030A201-RT
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microRNA
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BioTNT
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25T
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三、BioTNT QPCR microRNA 样本准备
3.1 组织样本准备
注意：BioTNT QPCR microRNA 检测的样本取样同Real
time PCR的组织取样与保存：
1、取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；
2、讲样本迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；根据组织块的大小，确定RNA 抽提方式；如果组织块非常小，可以采用磁珠法RNA抽提试剂盒（组织/细胞）A2010A103进行抽提；也可以采用柱抽提试剂盒进行抽提（ RNeasy Micro Kit（50） 74004 ），此时样本中不要加入trizol；如果组织块有100mg，可以采用trizol 法抽提总RNA的方式（RNA提取试剂盒(Trizol 法) A2010B0A01），进行样本的保存，在样本中加入1ml
trizol 浸没样本；
3、在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；
5、速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
BioTNT QPCR microRNA 的细胞取样与保存
1、悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；
2、根据细胞量进行后续抽提方式的选择，如果细胞量大于5*10的5次方，可以采用trizol 方式进行总RNA 抽提，如果小于此量，可以采用磁珠法RNA抽提试剂盒（组织/细胞）A2010A103进行抽提，或者采用Qiagen的柱式抽提（ RNeasy Micro Kit（50） 74004 ）；可以采用trizol 抽提的客户，可在样本中加入500ul
Trizol 到冻存管中，吹打混匀（RNA提取试剂盒(Trizol 法) A2010B0A01）；
3、在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
样本运输：干冰运输
3.3 血清/血浆样本准备：
建议采用血浆样本，可以得到相对更好的实验结果。
使用抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：1000g离心10分钟，分离血浆和细胞组分。（注意：血浆收集应使用抗凝管，抗凝剂可以用柠檬酸钠或EDTA等，但一定不要使用肝素抗凝，因为肝素对后续实验有较大影响。）将采集好的血浆转移至单独的冻存管，按照每400-500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。
3.4 全血样本准备：
请按照实际使用的收集方法，如注射器收集或真空收集管等，参考相应的厂商提供产品说明进行操作。
采集好全血，将采集好的全血转移至单独的冻存管，按照每500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。
3.5 石蜡样本准备：
石蜡切片，至少三片；或者提供石蜡块，常温保存。
3.5 石蜡样本准备：石蜡切片，至少三片；或者提供石蜡块，常温保存。
四、BioTNT
QPCR microRNA 检测使用的仪器
进行检测使用的主要仪器为QPCR， BioTNT 使用life technology最新款的ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统进行microRNA的QPCR
检测。 ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统在单一的高性能仪器上融合了您需要的所有实时荧光定量PCR特性，从而帮助您优化研究效率。ViiA™7系统具有简单的工作流程、直观的软件、触控屏界面以及使误操作降至最少的单键实验方案，可提供出众的重复性和最小的孔间和仪器间差异。
产率
ViiA™ 7系统适用于中等至高通量实时荧光定量PCR，可提升您的实验室效率。
快速的加热块更换——前开门设计使热循环加热模块的更换变得更容易，无需移动旁边的设备，如机械臂或计算机
简单的触摸屏界面——仪器触摸屏提供了一键式实验方案，可快速简单地完成各种应用Assay的设置
自动化兼容性——ViiA™ 7系统结合了Applied Biosystems® Twister® II 机器人，使您在自动化环境下实现效率最大化
整合
可与TaqMan® Array微流体芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容：实时荧光定量PCR分析的金标准，具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。
384 孔通量且无需机器辅助——采用TaqMan® Array微流体芯片，无需移液机器人或复杂的移液装置；只需加入您的样本和预混液，即可在ViiA™ 7系统上运行
与全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系统已经过优化，可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白质、非编码 RNA
和Pri-microRNA Assay)，从而获得清晰简洁的数据
性能
ViiA™ 7系统具有下列特点：
OptiFlex® 系统——增强型荧光检测，可实现准确且灵敏的数据分析
最大程度的多重分析能力——6 个可自由组合的激发和发射滤光片通道，可实现最多的染料组合和最大的多重反应能力
灵活的数据采集——多种升降温方法检测形式为升降温阶段的荧光数据采集提供了更多的灵活性
精确定量——在单色反应中可检测出低至1.5倍的拷贝数差异
ViiA™ 7软件具有：
直观的界面和创新的设计
便捷的自动化操作
更强大的数据分析
与高通量完全兼容
可扩展的软件构架
提供可选的附加性能，可升级至现有软件。
遵循美国联邦法规第21章第11节(21 CFR Part 11)——可选的SAE模块，提供记录安全、审计和电子签名信息，从而实现全方位的数据可追溯性
高分辨率熔解曲线(HRM)——采用内置的MeltDoctor™ 实验方案和校准，您可以缩短优化运行的时间，从而将更多的时间用于分析您的结果。通过方便的软件设置即可根据需要设置基因型种类的数目。
仪器图片：
五、BioTNT QPCR microRNA 检测标准服务流程
BioTNT microRNA 检测技术服务标准流程：1、 客户提供样本（组织，细胞或者RNA)，请参照取样与保存；2、 客户提供检测指标；3、与客户协商内参的选取（人，大鼠，小鼠均有两种内参可以采用）；4、采用 BioTNT
PCRmicroRNA qPCR Detection System ；5、客户样本验证进行抽提，特异性逆转录，QPCR 检测，验证系统是否好用；6、 客户的大批量样本进行处理，抽提和实验。 实验对象为组织样品，组织量不是很少的情况下，可以采用trizol
法进行抽提。取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，细胞数量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
组织块少或者细胞量小的时候，采用Qiagen 柱式抽提（RNeasy Micro Kit（50） 74004 ）。费用为120元/个； 血液样本，如血浆或者血清，采用Qiagen
miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）217184 ，费用为140元/个；石蜡样本，采用miRNeasy FFPE kit（50）217504，费用为160元/个；
7、 RNA 特异性逆转录得到内参CDNA， 对样本的质量进行验证；8、 大批量样本real
time PCR实验；使用仪器为：ABI 公司的Vii7；9、 靶基因表达水平结果分析，数据分析方法为：delta
delta CT 法；也可以采用相对定量的标准曲线法；10、 提供客户实验报告；包括方法，材料，设备，原始数据和计算数据的成套材料；
六、BioTNT microRNA
加尾法 QPCR 检测技术服务收费标准
☆ 实验步骤
组织或细胞总RNA抽提 80元(trizol抽提microRNA，一个组织或细胞标本)；
离心柱式抽提费用细胞/组织 120元/样；
血清/血浆 140元/样；
石蜡切片 160元/样
逆转录费用为120元/样本；
目的基因实时定量PCR 数据分析 双重复数据60元(一个标本一个指标)，三重复数据80元 （内参按照目的基因的一半进行收费）
引物等费用涵盖在这里面；
如需制备标准曲线，收取标准曲线制备费用200元/一个基因
一次取样，超过3个，免费；小于等于3个样品， 上海市区收取100元/次的干冰取样费用；上海郊区，不上门取样；
外地邮寄费用自理；
☆ 全套技术服务
您只需提供组织或细胞标本，我们为您完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
【您只需提供】
◇ 组织
◇ 或，高浓度的Total RNA
◇microRNA 名称
【我们向您提供】
◇ 实验材料、仪器、方法、步骤
◇ 供发表的引物序列、扩增曲线、熔解曲线
◇ 原始实验数据和计算好的正式实验数据
◇ 免费实验培训、技术支持
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资料名称
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资料描述
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A2030A001microPNA逆转录试剂盒（茎环法）
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A2030A001microPNA逆转录试剂盒（茎环法）
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A2030A002 microRNA PCR premix 说明书
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A2030A002 microRNA PCR premix 说明书
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A2030A003 microRNA qRT-PCR syb kit-2018说明书
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A2030A003 microRNA qRT-PCR syb kit-2018说明书
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Manual BioTNT 茎环法microRNA qRT-PCR 试剂盒使用说明
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Manual BioTNT 茎环法microRNA qRT-PCR 试剂盒使用说明
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PCR客户使用实验报告（mRNA）
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PCR客户使用实验报告（mRNA）
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数据报告说明——qPCR篇
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下载BioTNT的PCR数据后，如何解读并运用数据进行统计呢？
BioTNT提供数据报告说明书为您解惑。
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Analysis of Relative Gene Expression Data
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Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method, 相对定量经典文献
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