产品参数
--------------------------------------点击查看《产品说明书》--------------------------------------
LncRNA qPCR 实验体系与 mRNA 低丰度分子实验体系：一步法逆转录和 qPCR 检测指南
在分子生物学研究中，对特定核酸分子的精准检测至关重要。本文聚焦于一步法逆转录和 qPCR 检测技术，为您详细介绍其在 LncRNA 和低丰度 mRNA 检测中的应用。
样本 RNA 特征与检测适用性
从组织、细胞或全血中抽提的总 RNA，包含足量的 mRNA、LncRNA 和 microRNA，因此可用于这三类核酸分子的检测 。而从血清或血浆中抽提的总 RNA，所含 LncRNA 量较为微量。对于低丰度基因的 LncRNA 检测，推荐采用一步法逆转录 LncRNA 结合 qPCR 实验。
一步法技术优势
本实验采用的一步法逆转录和 qPCR 检测，运用单链特异性逆转录方式，与传统的 oligo dt 和随机引物逆转录方式相比，具有更高的灵敏度和特异性。
简要操作步骤
1、引物定制：可通过 biotnt 进行 LncRNA 引物定制。我们推荐 LncRNA 套餐，包含 LncRNA 引物、内参引物以及 LncRNA 专用一步法 RT - PCR mix，仅需 699 元即可获得 200T×10ul 体系。
2、试剂准备：
3、反应体系构建：
|
组份名称（目的孔）
|
组份名称（内参孔）
|
加量(μl)
|
反应终浓度
|
备注
|
|
Master PCR Mix
|
Master PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
|
Enzyme PCR Mix
|
Enzyme PCR Mix
|
2.5
|
1 x
|
|
|
lncRNA正向引物
（10μM)
|
内参正向引物
（10μM)
|
0.2
|
0.2 μM
|
用户自备
|
|
lncRNA反向引物
（10μM)
|
内参反向引物
（10μM)
|
0.2
|
0.2 μM
|
|
待检样本
|
待检样本
|
0.5-2
|
≤200ng
|
|
补加DEPC 水至总体积
|
补加DEPC 水至总体积
|
10
|
/
|
4、仪器设置：
|
步骤
|
温度
|
时间
|
循环次数
|
|
反转录
|
50℃
|
10-15分钟
|
1
|
|
解链及反转录酶灭活
|
95℃
|
5分钟
|
1
|
|
扩增
|
95℃
|
5-10 秒
|
40-45
|
|
?60℃
|
15-30 秒
|
|
熔解曲线分析
|
使用仪器配套软件进行
|
相关产品和服务
1、LncRNA 抽提：依据不同样本类型，选择对应的抽提方式。
2、LncRNA qPCR 引物定制
l 货号：cust - lncRNAp
l 规格：200ul×10um×2
l 客户必填信息：种属（可选）、基因信息编号、数据库（可选）。
l 客户可填信息：备注。
3、LncRNA 的序列查找，引物设计和实验方案推荐：BioTNT 提供专业的 LncRNA 引物设计验证服务。
l 序列查找：可通过 ncbi 或 ensemble 查找 LncRNA 序列。
l 序列比对：将查找到的 LncRNA 序列在 ncbi blast 中进行比对。设计的区段必须具有特异性。由于 ensemble 数据库与 ncbi 数据库存在差异，可能出现难以确认的序列，此时需与客户沟通确认。无法确认的序列不能进行设计；若找不到约 200bp 的特异序列片段，原则上也不能设计，对于较短的特异性序列，建议客户采用探针法设计。
l 引物设计原则：在找到特异性序列后进行设计，设计好的序列需再次与 RNA 序列和基因组序列进行比对。鉴于 LncRNA 通常表达量较低，为排除引物因素，推荐在同一个外显子内设计引物，这样设计出的引物可用基因组样本进行验证。此外，引物设计还需符合 qPCR 的一般原则，如引物长度、产物长度、TM 值、退火温度，且引物二级结构良好，可借助 oligo 软件进行引物结构分析。
l 引物特异性比对：选用同种属的基因组序列和 RNA 序列对引物进行特异性比对，确保引物符合特异性要求。
l 引物合成验证：引物采用 Page 纯化，合成后需通过 qPCR 实验验证，以基因组 DNA 为模板进行验证。理想的产物扩增曲线应为 S 型，熔解曲线为单峰，且 TM 值与引物设计的 TM 值相差不超过 2℃。
l 提供产品：提供上下游两支引物，浓度为 10um，体积为 200ul，采用标准的 qPCR 两步退火方式，可满足 500T 的检测需求。
客户准备事项
1、样本基因组处理：由于 LncRNA 引物采用同一外显子设计方式，扩增产物可在基因组上找到。若要获得准确的表达结果，样本需进行基因组去除处理，可在抽提或逆转录时进行。同时，建议客户抽提一些含基因组的样本，用于引物验证。
2、RNA 抽提方法：尽量采用抽提总 RNA 的方法。
3、逆转录方式：检测 LncRNA 时，因其序列无 poly A 尾，在抽提 RNA 后进行逆转录，可选择随机引物逆转录或特异性引物逆转录。使用 mRNA 的 oligodT + 随机引物逆转录方式，也可检测 LncRNA。
4、内参选择：根据抽提方式和样本情况，若抽提的是总 RNA，可选用 GAPDH、actb 作为内参。
LncRNA 引物定制下单表单填写内容
需填写种属、基因信息编号、数据库，以及备注（可选）。
